棉铃虫几丁质酶cDNA克隆及表达研究

【摘要】： 几丁质是昆虫表皮和围食膜的重要组成成分，昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质。几丁质代谢随昆虫不同生长发育阶段而变化并保持相对的稳定，对昆虫的正常的生长发育是至关重要的。而高等植物和高等动物体内则不含几丁质，几丁质酶对高等动植物没有直接的毒性，因此，选择几丁质酶来破坏几丁质结构或几丁质代谢的平衡来防治虫害，应具有较大的发展潜力。利用现代生物技术，将几丁质酶基因与其它抗病虫基因(如cry基因、核糖体失活蛋白基因、葡聚糖酶基因等)构成双价或多价基因组合，并在昆虫病原微生物或植物中表达，必将提高昆虫病原微生物和植物对有害昆虫的杀伤或防御效果，同时，也将有利于延缓有害昆虫抗药性的产生。 本研究针对昆虫几丁质酶基因时序性表达的特点，提取不同时段的棉铃虫几丁质酶、测定酶活性的基础上，确定了在棉铃虫几丁质酶活性较高的预蛹时期来提取mRNA，进一步通过RT-PCR、RACE等技术克隆了棉铃虫几丁质酶的cDNA，并且研究、分析了在原核表达体系中的表达情况，最后通过设计合成的保守区引物及限制性酶对甜菜夜蛾(Spodotera exigua)、粘虫(Mythimna seprata)、玉米螟(Ostrnia furnacalis)、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)、小菜蛾(Plutella xylostella)的几丁质酶cDNA进行了分析比较。结果如下： 1．棉铃虫几丁质酶活性测定 从三龄开始，每隔24小时取虫一次200mg左右，直至预蛹期，共取虫十次。分别提取几丁质酶做保温实验，测585nm OD值，确定了几丁质酶活性的高峰期为预蛹期，进而确定了提取mRNA的时机，为克隆时序性表达的昆虫几丁质酶基因奠定了基础。 2．棉铃虫几丁质酶基因克隆与分析 根据棉铃虫几丁质酶活性测定结果，提取预蛹期棉铃虫总RNA、mRNA，然后RT-PCR合成cDNA，制作扩增模板。 中国农业科学院硕士学位论文 棉铃虫几丁质酶cDNA克隆及表达研究 通过分析比较GenBank中己发表的几类昆虫的几丁质酶cDNA序列，发 现只有两个位点较为保守，这两个位点相距700hp左右。由保守区序列出发， 设计了多条引物，对CDNA进行PCR扩增，最终使用引物Spl． SpZ扩增得到 了 700hP的片段，并进行了克隆、测序。 根据上述片段测序结果，设计了内部引物，同时设计合成了两端接头引物， 进行了 RACEOapid axnpliflcation of cDNA ends）反应。我们分别对 cDNA做 了 5’禾 3二RACE、NEST－KACE及 SEWmG－RACE，扩增得到棉铃虫几丁质酶 CDNA全序列，大小为 1石kb，包括完整的帽子结构和 5’－UTR＊”端非翻译区）， 并在GenBank登录，登录号为AF51 5667。与己发表的昆虫几丁质酶cDNA比 较，同源性为44％斗7％，属于新的昆虫几丁质酶基因。 利用计算机分析该核昔酸序列，可知其编码框为1341个核昔酸，编码50kD 含 446个氨基酸的蛋白，推导等电点为 pHi 9．575，为碱性蛋白。 3．棉铃虫几丁质酶基因表达研究 根据两末端序列设计扩增全长引物EXS、EX3，同时在引物两端引入了该 基因中所不具备的BamHI、Safl切点，扩增大小为1．3kb左右，与预期结果一 致。 PCR产物用 BamHI、Sail双酶切后，与同样双酶切的 pET工 载体连接。 连接产物转化JM，提取质粒进行酶切及PCR分析，将此连接产物命名为 pCHT o 将pCHT转化BLZI（DE3），经IPTG诱导，提取菌体内容物SDS－PAGE电 泳。SDS－PAGE电泳显示，在50th附近没有特异蛋白带的出现，此结果表明 外源基因没有得到表达。 为了分析不表达的原因，提取该菌株的总RNA，然后RTICR合成CDNA， 使用全长引物EXS、EX3对其进行扩增，并进行了酶切鉴定，结果表明该基因 在BLZI（DE3）中能够正常转录。为了确定插入的基因序列是否正确，又进行了 测序。测序结果表明插入读码框的位点及基因序列完全正确。综上所述，分析 该真核基因在原核表达体系内不能正常表达的原因可能出在翻译阶段，比如密 码子的偏好问题等。正在尝试在酵母表达体系中表达。 2 中国农业科学院硕士学位论文 棉铃虫几丁质酶。DNA克隆及表达研究 4。昆虫几丁质酶基因保守区研究 提取甜菜夜蛾、粘虫、玉米螟、禾谷缢管蚜、小菜蛾总RNA，分别进行 RTICR，然后用保守区引物Spl、SpZ进行扩增，结果显示，甜菜夜蛾、粘虫、 玉米螟均能得到 700hp左右的特异条带，而麦蚜虫、小菜蛾则出现了多条带的 现象。表明了该保守区在甜菜夜蛾、粘虫、玉米螟中均有存在；同时证明了该 引物对甜菜夜蛾、粘虫等昆虫的有效性，为今后的基因克隆工作打下了基础。 此外，通过PCR产物限制性酶酶切分析发现，甜菜夜蛾、粘虫、玉米螟、禾谷 缢管蚜、小菜蛾的几丁质酶CDNA序列，与棉铃虫相比，都存在着不同程度的 差异。