橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1所产木聚糖酶的纯化、酶基因的克隆及表达

【摘要】： 木聚糖酶可将木聚糖降解成低聚糖和木糖。木聚糖酶在饲料、制浆造纸、食品、能源工业中都显示出广阔的应用前景。许多微生物可产生木聚糖酶。我们选择的实验材料是一株橄榄绿链霉菌A1(Streptomyces olivaceoviridis A1)。此菌株能胞外分泌木聚糖酶。从它的培养液中分离纯化出两种木聚糖酶：43kD的XYNA及23kD的XYNB。XYNA的最适温度为60℃；最适pH为5.6；在55℃下以4-O-Me-D-glucurono-D-xylan的K_m值和V_(max)分别是3.32(g/Kg)和15.72(μmol／ml·min)；SDS、EDTA对它有轻微的抑制作用；XYNA无纤维素酶活性；胃蛋白酶、胰蛋白酶处理30分钟，对酶活性无影响。XYNB的最适pH为5.2，最适温度为60℃，在55℃下以4-O-Me-D-glucurono-D-xylan为底物的K_m值和V_(max)分别为22.1(g/Kg)和105.26μmol／ml·min。Mg~(2+)、Cr~(3+)对XYNB有轻微的激活作用。XYNB无纤维素酶活性。胃蛋白酶、胰蛋白酶37℃下处理30分钟，对酶活性无影响。将纯化出的XYNA及XYNB进行N端序列测定。结果XYNAN端十个氨基酸序列与已发表的木聚糖酶FXYN的100％同源，所以直接根据所发表的编码FXYN的基因全序列资料，设计和合成了二段引物，利用PCR技术，克隆出xynA1全序列，测序结果与发表的编码FXYN的基因序列完全一样，再分别克隆出不含信号肽的xynA1-w和含有信号肽的xynA1-s序列，并分别将两段基因克隆进大肠杆菌表达载体pET-22b(+)上，在大肠杆菌BL21(DE3)中都得到特异性表达，并且都能检测到木聚糖酶活性。将xynA1-w序列克隆进酵母表达载体上，在毕赤酵母GS115中得到高效特异性表达。XYNB N端十个氨基酸序列与已发表的最高同源性为90％，根据N端序列测定结果及C端保守序列分别设计了两段引物，经PCR扩增出编码XYNB成熟蛋白的核苷酸序列。将此序列克隆进表达载体pET-22b(+)上，在大肠杆菌BL21(DE3)中也得到特异性表达，并有正常的生物学活性，证明了基因xynB1的生物学功能。将xynB1序列克隆进酵母表达载体pPIC9α上，在毕赤酵母GS115中得到高效特异性表达。对xynA1与xynB1的核苷酸序列进行分析，发现它们之间的同源性仅为40％，并可以断定XYNA属于F／10组木聚糖酶，而XYNB属于G／11组木聚糖酶。 将所测出的基因xynB1的成熟蛋白部分核苷酸序列与GeneBank上的木聚糖酶基因序列进行同源比较，最高同源性为86％，氨基酸序列最高同源性也为86％，并且与之同源性最高的基因所表达的酶酶学性质与XYNB酶学性质有较大差异。综合这些因素，可证明xynB1为新基因。此序列已被EMBL收录，收录号：AJ292317。