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棉铃虫气味结合蛋白的分子结构及对气味的识别

王桂荣  
【摘要】: 棉铃虫是我国棉花生产上的重大致灾性害虫。研究表明,棉铃虫能够感受空气中的挥发性化合物,并将此作为交配、觅食和寻找生殖场所的信息,这一特性可以用来监测和诱杀棉铃虫。近年来,对棉铃虫的行为化学模式进行了广泛的研究,但是对棉铃虫嗅觉识别的分子机制国内外几乎未见报道。对这方面的研究不但可以阐明棉铃虫行为反应的本质原因,为研制高效的引诱剂或驱避剂提供理论依据,而且对于研究脊椎动物的嗅觉识别机制具有重要的启示作用。本论文利用基因克隆、表达的方法获得了纯化的棉铃虫气味结合蛋白,在此基础上制备了棉铃虫气味结合蛋白高度特异性的抗体,对两种气味结合蛋白在棉铃虫触角中的分布进行了免疫定位研究;同时利用差异显示PCR结合RACE技术克隆了一个与嗅觉有关的触角特异表达基因。主要结果如下: (1)扫描和透射电镜观察结果表明:棉铃虫触角呈线状,由柄节、梗节和鞭节组成。在棉铃虫雌雄蛾触角上观察到了以下5类感器:即毛形感器、锥形感器、刺形感器、耳形感器、腔锥感器。棉铃虫触角上的嗅觉感器基本上由表皮、感觉神经元、感受器淋巴液以及鞘细胞组成。棉铃虫触角上的两类嗅觉感器,即毛形感器和锥形感器的内部形态结构具有明显的区别。 (2)利用PCR结合RACE技术克隆了3个棉铃虫OBP基因(PBP-Harm、GOBP1-Harm、GOBP2-Harm,GenBank中序列号分别为AJ278992、AY049739和AJ278991)和一个甜菜夜蛾GOBP2基因(GOBP2-Sexi,GenBank中序列号为AJ294809)。 (3)Northern杂交结果表明:PBP-Harm和GOBP2-Harm都在棉铃虫触角中特异性表达。PBP-Harm在雄蛾触角中表达量明显比雌蛾中高,在触角发育的过程中,PBP-Harm大约在成虫羽化前四天开始表达,在成虫羽化前两天达到峰值,这一高水平表达一直延续到成虫羽化。GOBP2-Harm在雌雄蛾触角中表达量相同,在触角发育的过程中,GOBP2-Harm大约在成虫羽化前三天开始表达,在成虫羽化前一天达到峰值,这一高水平表达一直延续到成虫羽化。Southern杂交表明:PBP-Harm和GOBP2-Harm都非性别连锁,这两个基因都是以单拷贝的形式存在。 (4)构建了棉铃虫PBP-Harm和GOBP2-Harm的原核表达载体pGEX/PBP-Harm和 PGEX/GOBPZ-Harm,并在大肠杆菌中成功进行了表达,经亲合层析和凝胶过滤获得 了高纯度的目的蛋白,免疫兔子制备了高度专一性的抗体,然后对PBPHarm和 GOBPZ-Harm在棉铃虫触角感器中的分布进行了免疫定位。结果表明:PBP和 GOBPZ 存在于触角毛形感器或锥形感器的淋巴液和感受器着生腔中,不存在于树突或感受器 表皮壁中。在雄蛾触角中,P*P主要存在于毛形感器中,不存在于锥形感器中:而 GOBPZ主要存在于锥形感器和一些中等大小的毛形感器中。然而,在雌蛾触角中, PBP存在于少部分的锥形感器和中等大小的毛形感器中,长形毛形感器中不存在 PBP;而GOBPZ不但存在于大部分的锥形感器和部分中等大小的毛形感器中,而且 还存在于部分的长形毛形感器中。 *厉用差异显示PCR的方法获得了3条棉铃虫触角专一性CDNA片段。其中克隆 A4与昆虫谷肤甘肽七-转移酶基因具有明显的同源性,表明克隆A4属于GST超 基因家族。利用5’-RACE克隆A41的5’端片段,拼接以后获得了该基因的序列,命 名为GSThaoto在GenBank中序列号为AY058242。Northern杂交表明,GST山aolf 在棉铃虫触角中专一性表达,并且在雄蛾触角中表达量明显比雌蛾触角中的表达量 高。生物测定结果也表明雄蛾触角中的GST酶活性明显高于雌蛾触角。


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