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棉花生殖器官发育相关基因的克隆与表达研究

李继刚  
【摘要】: 转基因抗虫棉的研制成功与生产上的广泛应用,带来了巨大的社会效益与经济效益。但是,无论国内还是国外抗虫棉品种都普遍存在“抗虫棉生长前期抗虫性强,后期抗虫性减弱”这一问题,解决问题的途径之一是把35S启动子换成在发育棉铃具有较高活性的启动子;棉花功能基因的克隆已经成为棉花研究的一个新的热点。为此,开展了棉花生殖器官发育相关基因的克隆及其表达特性研究工作,其主要结果如下: 比较了棉花RNA提取酚-SDS法和蛋白酶K-热硼酸法的提取效能,结果表明蛋白酶K-热硼酸法提取的棉花RNA具有较好的完整性并且蛋白等杂质去除得比较干净,具有较高的纯度,RNA溶液外观上没有任何颜色,棉酚褐化现象得到了很好的抑制;而通过酚-SDS法提取的RNA虽然在完整性、产率等方面与热硼酸法相近,但是在去除杂质方面不如热硼酸法。而且,酚-SDS法无法或者很难避免棉花组织在提取过程中发生褐化,确定热硼酸提取法作为实验所用RNA来源。 首次构建了构建了花后10天棉铃壳cDNA文库,未稀释文库滴度达到7×10~6(pfu/mL),蓝白斑计数计算重组率为90%,为棉铃发育基因及其启动子的克隆研究打下了基础,目前国内外未见类似报道。以棉铃壳cDNA文库提取的DNA为模板,通过PCR法分析了棉铃壳(10dpa)基因表达丰度,该方法与基因芯片分析技术相比,易于在一般实验室实施,而且比直接测序调查丰度的方法节省成本,目前未见该方法在植物基因表达丰度研究上的应用,具有一定的创新性; 得到2个在棉铃壳表达丰度较高的cDNA克隆,测序表明,一个克隆编码Rubisco活化酶2基因的一个片断,另一个为未知序列,该序列在EST库中,与多个植物果实EST序列具有同源性,表明该片段所代表基因可能发挥果实发育所必需的某种功能。通过Northern杂交分析了这两个序列在棉花6个组织部位的表达情况,结果表明,前者在棉花铃壳、茎和叶片中杂交信号比较强,但是纤维、花和根未检测到杂交信号,表明它倾向于在绿色组织部位高表达,而在纤维、花序以及根系中不表达或者表达很弱,有一定的组织部位偏爱性。后者除了花和茎中没有信号或者信号很弱之外,在其他4种部位都检测到较强的信号,并且以在棉花铃壳最高,叶片或根中次之,然后是棉花纤维。 根据MADS-box蛋白家族MADS-box区的保守序列设计简并引物,通过RT-PCR方法,在棉花铃壳(10dpa)和花序中得到17个MADS-box基因片段。从GenBank 中国农业科学院博十学位论文 * 中取出 48个具有代表性的 MADS-bOX基因,借助于生物软件分析了 17个片段所属 的亚类,并对它们所代表基因的表达特性进行了推测,结果表明,属于B功能基 因的有5个,属于C功能的有11个以及1个属于未知功能亚类,这对于进一步基 回克隆全长基囚及启动于具有一定的指导意义。 通过3’RACE方法对MAD卜bOX全长CDNA的克隆进行了探索。结果在棉花纤 维中克隆得到一个编码丁tp蛋白前体的全长 CDNA序列,另一个是未知 CDNA )7段, 它与木棉 7-10dp叫诧花纤维 CDNA文库中多个 EST序列具有较高同源性(70%以上), 表明它可能编码一个未知功能棉花纤维发育相关基因。NO。叩。,。杂交显示,该基 因主要在棉花纤维中表达,在棉花铃壳和花中,检测到较弱的信号。 以上工作为棉铃发育基因及其启动于的克隆研究打下了基础。


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