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表达H3亚型猪流感病毒HA基因的重组伪狂犬病毒的构建及猪流感病毒和伪狂犬病毒特异性鉴别诊断方法的建立

倪建强  
【摘要】: 伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)归属于α疱疹病毒亚科,主要引起猪的伪狂犬病(PR),该病以仔猪的神经学症状和妊娠母猪的生殖障碍为主要特征。目前世界上包括我国在内广泛使用的预防此病的疫苗均带有gE基因缺失的表型特征。猪流感(SI)是由A型流感病毒引起的猪的呼吸道疾病或疾病综合征,临床以仔猪的严重呼吸道疾病、妊娠母猪的流产和部分成年猪的死亡为主要特征。此外,猪是禽和人流感病毒均可感染的唯一动物,是不同来源流感病毒发生重组,产生新的流感毒株的中间宿主。因此,通过免疫接种预防猪流感对食品安全和公共卫生具有重要意义。本试验的目的是以gE基因缺失的PRV为载体构建可以表达SIV HA基因的重组病毒疫苗用于预防这两种病,同时,基于此重组病毒的特点,建立可以区分此重组病毒疫苗和PRV及SIV自然感染的鉴别诊断方法。 本研究首先对SIV A/Swine/Inner mogolian/547/2001(H3N2)毒株(简写SWNM547)的HA基因进行了RT-PCR扩增与测序,结果表明HA基因包含完整的开放阅读框,全长1701bp,编码566个氨基酸残基。通过与其它7株国内SIV分离株和6株GeneBank中的H3流感病毒HA序列比较分析,结果表明分离自我国不同地区的8株H3 SIV核苷酸序列同源性均在95%以上,且与禽流感病毒(AIV)经典代表株DKUK-63序列同源性在95-100%之间,证实我国H3 SIV HA基因来源于禽的流感病毒。虽然基于HA的疫苗不能提供不同亚型病毒的交叉保护,但对于同一亚型的病毒却有着良好的免疫保护力。 克隆伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株基因组中的KpnⅠ J片段,然后亚克隆其中的KpnⅠ-PstⅠ片段,缺失重组质粒中的EcoRⅠ位点和NotⅠ-HindⅢ片段;再用AccⅠ切去378bp,在此缺失位置插入来源于pCR3-Uni的CMV启动子、多克隆位点和BGH polyA信号,构建了PRV转移载体pBdTK-Uni。在此基础上,进一步用TthlllⅠ酶切后,补平插入带有SV40启动子的大肠杆菌β—半乳糖苷酶报一告基因(LacZ),获得通用转移载体pLTK-Uni。然后定向亚克隆SWHA基因于多克隆位点,获得重组转移载体pLTK-HA。利用脂质体介导的方法,将pLTK-HA与PRVBartha-k61基因组共转染于亚单层Vero细胞,依据报告基因LacZ在细胞中的表达,筛选蓝色蚀斑的重组病毒,经数次蚀斑纯化后,PCR鉴定、Western-blot分析。结 果表明所获得的重组病毒(rPRVHA)遗传性状稳定,在培养细胞中能稳定的表达 与 SIV HA具有相似生物学活性的外源蛋白,为进一步制备抗猪流感的重组伪狂犬 病毒活载体疫苗奠定了基础。 为了区分此重组病毒疫苗免疫的动物和自然感染PRV和SIV的动物,本项研 究利用基因工程抗原建立了两种分子鉴别诊断方法。 虽然A型流感病毒变异频繁,但其核蛋白(NP)是其保守性蛋白,具有种群 和型的特异性。本试验经 RTPm扩增 T A/S一eilon③iangi3厘000(H3NZ)株 SW 的NP基因。酶切鉴定后亚克隆NP基因于原核表达载体pET30(a中获得重组质粒 pETNP。SDS-PAGE、WestC:ttkblot分析表明表达的NP具有良好的抗原反应活性。 利用重组的 NP蛋白进一步建立了猪流感琼脂扩散试验(AGrp)诊断方法,对其它 8种猪病原阳性血清和 40份送检血清样品进行 iq’- AGrp检测,同时与血凝抑制试 验结果相对比,二者的符合率达 95%以上。基于重组地抗原的 AGIP可用于检测 SIV感染,而rPRVHA疫苗免疫的动物不会产生抗NP蛋白的抗体,因此,也可用 于SIV自然感染和重组疫苗免疫的鉴别诊断。 根据重组伪狂犬病毒载体疫苗缺失gE基因的特性,利用 PCR技术扩增了 gE 基因除信号肽和跨膜区外所有反应区域的核苦酸序列,并将其定向亚克隆于 pGEX七P4中,获得重组表达载体pGEXgE。经SDS-PAGE、Westeth七*分析证 实表达的重组蛋白具有良好的抗原反应活性。将表达产物利用亲和层析法纯化,制 备抗原建立了ELISA诊断方法。通过对ELISA特异性、敏感性及工作条件的优化 试验,确立了反应的最佳程序。统计学分析48份阴性血清的检测结果,得出判定 标准。利用所建立的 gEELISA方法对 400余份送检血清样品检测,结果证明该方 法特异性强、敏感性高、重复性好,与国外竟争 gEELISA相符率在 93%以上。 总之,本试验获得了表达 H3 亚型 SIV HA基因的重组伪狂犬病毒(呈 gE*KAs”LacZ十表型人并分别建立了可以特异性地检测SIV和PRV野毒感染的 鉴别诊断方法,这将对清流感和伪狂犬病的综合防制及根除具有重要意义。


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14 ;流感防治知识解答[J];青年科学;2009年06期
15 ;读编往来[J];广东科技;2009年11期
16 王晔;;一种病毒的三重身份[J];新世纪周刊;2009年14期
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1 本报驻墨西哥记者 王新萍;猪流感病毒折腾墨西哥[N];人民日报;2009年
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