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中国马传染性贫血病毒驴强毒株致病性分子克隆的建立及其生物学特性的研究

王晓钧  
【摘要】: 马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus,EIAV)是反转录病毒科慢病毒属的重要成员,是引起马属动物传染性贫血病的病原。该病以间歇热,贫血、消瘦为特征,呈慢性进行性,终生持续感染,以死亡而告终,少数病例可发生急性死亡。二十世纪七十年代沈荣显等通过体外细胞传代致弱路线研制成功了马传贫驴白细胞弱毒疫苗,并以之成功控制了马传贫在中国的流行,是迄今为止世界上唯一大规模应用的慢病毒疫苗。该疫苗具有良好的安全性和有效性,成为研究包括艾滋病毒在内的慢病毒疫苗的良好模型。 我国马传贫弱毒疫苗致弱路线是:将一株来源于马体的EIAV超强毒力毒株LN经过驴体连续传代100余代使病毒毒力增强后获得了驴强毒株DV(对马和驴均100%致死),然后将DV连续通过驴白细胞进行体外培养驯化,使得病毒毒力完全丧失,而保持了良好的免疫原性,最终培育成功EIAV驴白细胞弱毒疫苗DLA(沈荣显等,1979),DLA进一步通过驴胎皮肤细胞培养驯化,获得了皮肤细胞弱毒疫苗株FD。 本实验中将EIAV驴强毒DV体外感染驴白细胞培养物,一定时间后收获病毒(本文中简称DV116),提取EIAV前病毒DNA,以PCR法分别扩增并克隆了包含全长基因的三段前病毒DNA片段,以双脱氧法测定了DV116病毒全基因序列共8236个核苷酸。通过分析发现,包括DV116在内的已测定的中国疫苗致弱过程中的关键毒株的基因序列与国外毒株相比,同源性只有78.4%—80%之间,基因离散率为22.4%—23.3%,gag基因与国外毒株的基因同源性为79.7%—81%,基因离散率达到22.3%—23.1%;env区与国外毒株的同源率只有72.8%—74.1%,基因离散率达到了29.6%-31.6%。提示中国毒株在基因进化地位上明显不同于欧美毒株,可能代表了一个未被注意的新EIAV基因亚型。 将包含全基因片段的三个基因克隆以限制性内切酶消化后顺次连接克隆到载体pTZ18R上,构建了4个全长基因的分子克隆,分别命名为pD30343、pD70333、pD70343、pD70344,其中两个转移到低拷贝载体pLG338上,命名为pLGD30343、pLGD70344。将此克隆体外转染驴胎皮肤细胞和驴白细胞,连续盲传三代并检测反转录酶活性,电镜观察病毒粒子,获得了一株具有感染性的EIAV病毒粒子,命名为pD70344V。将此衍生病毒第四代驴白细胞培养物(反转录酶相对含量 博士学位论文 摘 要 中国农业科学院 400P旮ml)静脉接种两匹健康驴(每头驴ZmlX可引起动物典型发病。两头驴(编 号 03008和 03009)分别在接种后第 9天和第 14天体温升高 40aC以上,稽留数日, 产生急性病毒血症,其中一头于发热后期实施迫杀,另一头驴在第一次发热后自 然死亡,病原学和病理学检查判定为急性马传贫。这一结果说明本文所构建的感 染性分子克隆株pD70344V具有其亲本DV株的基本生物学性状,是一株具有高 致病力的衍生病毒。 本实验首次构建了一株完全来源于EIAV强毒基因的感染性分于克隆,该克隆 衍生病毒对驴有高致病力,可导致驴发生典型传贫死亡。该克隆的建立为进一步 阐明EIAV致病机理和致弱机理打下了坚实的基础。通过分析认为我国EIAV毒 株在基因遗传进化上不同于经典的欧美毒株,是一个新的基因亚型。


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