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转几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因的甘蓝型油菜及其对菌核病抗性的研究

王新发  
【摘要】: 油菜是世界上食用植物油和植物蛋白的主要来源之一,也是我国最重要的油料作物,2000年以来种植面积已突破1.1亿亩。菌核病是我国油菜的最主要病害,是油菜生产的最主要限制因子之一。抗菌核病研究成为油菜抗病研究的重要方面,利用多个防卫基因的协同作用是一个有效的选育抗病新品种的研究策略。 本研究以甘蓝型双低杂交油菜亲本(恢复系、保持系)为材料,在对以游离小孢子、子叶柄为受体的农杆菌介导的转基因方法上进行了较为广泛的研究;将双价基因几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因导入杂交油菜亲本中,进行了抗菌核病转基因的研究。获得的主要结果如下: 1.主要研究了利用甘蓝型杂交油菜亲本游离小孢子与农杆菌共培养方法进行外源基因转移中几个因素对小孢子胚胎发生的影响,建立了农杆菌介导的甘蓝型油菜游离小孢子的遗传转化体系,并获得了恢复系转双价基因单倍体独立植株10株,通过秋水仙碱加倍,9株已获得自交种子。 2.通过对影响农杆菌侵染的多个因素,如农杆菌悬浮培养基、农杆菌菌液浓度及处理时间、共培养时间及影响Vir区基因活化的酚类物质、pH、无机盐浓度等参数的优化筛选,建立了高效的农杆菌介导的甘蓝型杂交油菜亲本的双价基因的遗传转化体系。恢复系最高转化频率达到8.8%,保持系最高转化频率为5.3%。 3.改进了油菜的转化方法,采用共培养后,延迟Kan筛选,生根培养时提高Kan浓度和降低蔗糖浓度,可有效地淘汰假阳性植株。这一方法显著提高转化效率。 4.共获得109株独立转基因植株。其中恢复系获得66株,包括棚34-1获得6株,棚40获得41株,93275获得9株;14786获得10株;保持系获得43株,包括95B、96B、98B分别获得9、23、11株。 5.PCR、PCR-Southern blot和Kan抗性性状在T_1代分离结果表明,外源基因已整合至油菜基因组中。 6.离体叶菌丝接种和大田自然侵染鉴定以及几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的测定结果表明,多数转基因植株的外源基因得到了表达,一些转基因植株表现出抗性的明显提高,如转基因株系棚40-12发病率、病指比对照未转基因棚40和中油821分别降低78.7%、85.2%和77.4%、83.5%;而一些转基因植株的抗性没有得到提高。 7.Kan喷施法可进行田间大规模的转基因植株的阳性植株的早期鉴定、转基因株系的分离研究及纯合株系的获得。


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