O型口蹄疫病毒多基因DNA疫苗的研制

【摘要】：为研制带有O型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)China99株结构蛋白基因及多个非结构蛋白基因的DNA疫曲，本研究通过定点突变方法和PCR扩增方法，获得包含有FMDV China99株结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C以及部分2B、3B编码基因的片段P12X3C和包含有FMDV China99株结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C、3D以及部分2B、3B编码基因的片段P12X3C3D，将获得的基因片段直接／酶切后与同样处理的真核表达质粒连接，分别得到重组质粒pcDNA3.1／P12X3C和pcDNA3.1／P12X3C3D、pTARGET／P12X3C3D；对重组质粒进行序列测定、分析，并将重组质粒分别转染BHK-21细胞，通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中FMDV抗原的表达，用电子显微镜观察病毒空衣壳的组装；为评价重组质粒作为DNA疫苗对实验动物及本动物的免疫效果，将重组质粒经肌肉注射方法接种豚鼠，并与酵母表达的纯化FMDV China99株3D蛋白及带有牛α干扰素(IFN-α)的真核表达质粒pcDNA3.1／IFN分别／同时免疫，第二次免疫后第三周豚鼠攻以100ID_(50)或1000ID_(50)的O型FMDV China99株：随后将质粒pcDNA3.1／P12X3C、pcDNA3.1／P12X3C3D与带有牛α干扰素(IFN-a)的真核表达质粒pcDNA3.1／IFN同时免疫牛，三周后经牛舌皮攻以10~4ID_(50)的O型FMDV China99株。结果表明： 1)FMDV基因片段正确克隆到真核表达质粒载体上，FMDV China99株P12X3C基冈和P12X3C3D基因序列大小分别为3042bp和4452bp，分别编码1014利1484个氨基酸。与亲本毒株China99株的相应编码序列比较，同源性分别为99.6％和99.7％。 2)重组质粒均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白；带有内含子的质粒pTARGET／P12X3C3D蛋白表达水平比没有内含子的质粒pcDNA3.1／P12X3C和pcDNA3.1／P12X3C3D高1-2倍，且其表达的蛋白能正确组装成病毒空衣壳。 3)质粒pcDNA3.1／P12X3C单独免疫豚鼠斤第2周诱导机体产生了特异抗体利中和抗体以及较强的T淋巴细胞增殖反应，攻毒后豚鼠获得完全保护。但与3D蛋白共同免疫后，抗体水平没有明显提高，攻毒后的保护率也明显低于质粒pcDNA3.1／P12X3C单独免疫组。 4)质粒pcDNA3.1／IFN与FMDV重组质粒共免疫的豚鼠特异性抗体水平在第一次免疫后出现，并在第二次免疫后的第一周进一步提高；各免疫组的脾脏T淋巴细胞均在第一次免疫后出现增殖反应，并在第二次免疫后进一步增强；质粒pcDNA3.1／P12X3C3D与pcDNA3.1／IFN共免组的保护率为25％。 5)所有牛在免疫后均出现特异抗体：T淋巴细胞在免疫后明显增殖：攻毒后免疫牛发病迟缓、病变程度较轻。 这些真核表达质粒的成功构建为口蹄疫基因免疫的研究提供了基础，并为从分子水平上防制FMD开辟了新的途径。