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小麦族A、S、D二倍体种全长cDNA文库构建及序列初步分析

毛新国  
【摘要】:普通小麦(T.aestivum)为异源六倍体(AABBDD),基因组庞大(1.6×10~(10)bp),重复序列多(约90%),发掘、克隆小麦新基因意义巨大。全长cDNA文库中绝大多数克隆不仅包含完整的阅读框架,还拥有5′和3′端的非编码区,是进行功能基因组学研究的一条有效途径。 在引进、消化吸收的基础上,我们对Cap-trapper法做了一些具体的改进,形成了一套简单易行的技术体系,建立了我们自己的全长cDNA文库构建技术平台。利用改进的Cap-trapper法,分别构建了乌拉尔图小麦(T.urartu)A基因组,拟斯卑尔脱(Ae.speltoides ssp speltoide)S基因组和粗山羊草(Ae.squarrosa ssp strangulata)D基因组的全长cDNA文库,库容量达到了10~6,重组率超过95%,文库中全长基因的比例分别为70%、89.6%和70%。基因功能注释表明,在得到的2089个基因中,有1584个基因为全长基因,1346个为小麦全长新基因,其中A基因组569个,S基因组有553个,D基因组468个。 密码子使用的偏爱性是在生物长期进化历程中逐渐形成的,影响偏爱性的因素有多种,如G+C含量,基因表达水平,基因的长度,tRNA的丰度等等。我们以得到的2089个基因为考察对象,对小麦中密码子使用的偏爱性进行了分析,统计结果表明A、S、D三个基因组间密码子使用偏爱性没有差别,但单个基因组中密码子使用偏爱性明显,如AAG(Lys),GAG(Glu),GCC(Ala)使用频率超过了35‰,GCC(Ala)的使用频率甚至超过了45‰;另外,还有3种密码子的使用频率超过了30‰,12种密码子的使用频率超过20‰。通过与水稻中密码子使用的偏爱性比较,我们发现在拥有4~6个同义密码子的氨基酸中,水稻和小麦在优先使用密码子方面存在明显的不同,水稻中优先使用密码子的末尾碱基倾向于U和C,而小麦中则倾向于G和C。 比较基因组学是基因组学研究的重要内容,通过进行不同层次的基因组比较,不仅可以了解不同物种的基因及基因组在结构、功能以及表达调节方面的差异,而且有助于揭示物种的起源和进化的动力。我们利用分子进化的分析方法,以测序得到的22个基因为考察对象,通过构建基因进化树来探索小麦A、S、D三个基因组的相互关系。统计结果表明,来自A、D基因组的基因间亲缘关系普遍较近,而与S基因组的关系相对较远。用EST进行的验证分析也得出了同样的结果。这一结果在之后的SNPs分析中也得到进一步验证。 SNPs具有数量多,分布广,高度稳定,适于快速、自动化检测,应用前景广阔等特点,因而倍受青睐。我们以测序得到的2089个来自小麦不同基因组的基因序列为源序列,利用AutoSNPsFinder软件,从Genbank中小麦EST库中检测到1296个SNPs,开辟了一条通过单基因组测序发掘小麦SNPs的有效途径。在所得的SNPs中,有397个自A基因组,322个来自S基因组,420个来自D基因组:另外,A和D基因组共同的SNPs有154个,A和S,S和D,A和S和D基因组共有的SNPs各仅有1个。分析表明小麦中碱基平均变异率为0.914‰,与大豆中的研究结果(0.97‰)非常接近,而与玉米中的研究结果(6.3‰)相差较远。


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