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BmNPV和AcMNPV egt 基因启动子特性及家蚕海藻糖酶基因启动子活性的滞育激素调节研究

沈兴家  
【摘要】:昆虫杆状病毒是潜在的无污染杀虫剂,但是其缓慢的发病致死作用,极大地限制了它作为杀虫剂的应用,杆状病毒的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(egt)基因为病毒复制的非必需基因,缺失egt基因的病毒可以加速宿主昆虫的死亡,提高杀虫效果;而且可在egt基因启动子下游插入标记基因或有用蛋白质基因,有利于重组病毒的筛选和表达产物的加工。 本文分析了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)egt启动子及家蚕(Bombyx mori)和野桑蚕(Bombyx mandarina)海藻糖酶基因(trehalase)启动子的特性,研究了蜕皮激素(ecdysone)、保幼激素(JH)和滞育激素(DH)对egt基因启动子和trehalase基因启动子活性的调控。 1、BmNPV和AcMNPV egt启动子的特性 从BmNPV和AcMNPV)基因组DNA扩增出不同长度的egt启动子区段,构建egt启动子控制的荧光素酶基因(luc)报告质粒。瞬时表达分析结果表明:BmNPV和AcMNPV egt启动子只有相似的特性,其转录活性需要病毒因子的反式激活,而且病毒感染后24h才检测到转录。 2、BmNPV hr3增强egt启动子的活性 在BmNPV和AcMNPV egt启动子控制的报告基因下游插入BmNPV hr3,构建带hr3的报告质粒。瞬时表达分析显示,在体外和体内BmNPV hr3分别使egt启动子活性分别增加1200-1600和130倍,但egt启动子活性仍需要病毒因子的反式激活,而且在病毒感染后18h才检测到。 3、egt基因启动子的功能区 不同长度的BmNPV和AcMNPV egt启动子控制的报告基因表达分析表明,egt翻译起始位点ATG上游-159 bp区段包含启动子的基本结构,但转录活性接近消失;与病毒因子作用的转录调控顺式元件主要存在于翻译起始位点ATG上游-159~-309区段内。 4、外源昆虫蜕皮激素和保幼激素对egt基因启动子活性的调控 在体外ecdysone对egt启动子活性有负调节作用,0.5μg/ml时作用不明显,而≥1.0μg/ml时明显降低egt启动子活性。相反,在体内每头幼虫注射4-8 μg ecdysone,egt启动子活性提高约2.6-15倍,JH对egt启动子活性有正调节作用,0.5-2.0 μg/ml培养基或50-150 μg/ml溶液涂布幼虫体表分别使启动子活性增加0.75-1.5倍和0.76-4.4倍 5、家蚕和野桑蚕海藻糖酶基因启动子特性 家蚕和野桑蚕trehalase启动子在Bm5和Sf21细胞中都有很低但明显的转录活性,家蚕trehalase启动子在同源的Bm5细胞中的转录活性明显高于在异源的Sf21细胞中的活性。 6、滞育激素对家蚕海藻糖酶基因启动子活性的调控 在Bm5细胞培养基中,DH浓度13-33 nmol/L范围内都显著增强家蚕trehalase启动子的活性,其中以20-27 nmol/L增强作用最大,提高约为1.3倍;浓度为50 nmol/L时无显著的影响。说明DH对家蚕trehalase启动子的调控呈现明显的剂量效应,源自家蚕卵巢的Bm5细胞系可能存在着DH的受体。


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