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用毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白的研究

孙怡  
【摘要】:皮蝇素A(Hypodermin A,HA)是皮蝇第一期幼虫在宿主体内移行过程中分泌的一种丝氨酸蛋白酶,具有抗炎、抑制补体反应和延缓免疫反应等功能,很可能成为控制牛皮蝇蛆病的候选疫苗之一。 本文首次建立了用毕赤酵母表达系统表达HA的技术,对表达条件进行了优化研究,并用纯化HA蛋白进行了免疫保护试验。将HA基因连接到质粒pPIC9k上,构建重组转移质粒pPIC9k-HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115中,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含甲醇的培养基中分泌产生目的蛋白,培养3天后收取上清,用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白约为30KD。Western-blotting表明该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示具有酶活性。对诱导3天后逐渐出现的50KD蛋白的糖基化显色反应表明该蛋白为超糖基化蛋白,氨基酸含量分析表明该蛋白氨基酸组份与30KD重组HA蛋白一致。单因素改变表达条件试验结果表明,甲醇浓度0.5%,溶氧量70%以上,诱导56小时的情况下表达产量最高,可达1500mg/L,显著高于其他表达方法。 用30KD蛋白及3天后出现的50KD蛋白免疫家兔,三周后抗体水平达到峰值,后缓慢下降。50KD蛋白免疫效果较30KD蛋白好,差异非常显著(P0.01)。用50KD蛋白免疫自然感染牦牛,七月免疫组与九月免疫组感染率分别为83.3%和36.3%(对照组为55.5%);平均感染强度分别为6.5和4.2(对照组为13.0),差异不显著(P0.05)。免疫后,抗体水平上升,三个月后缓慢下降。九月免疫组免疫效果较七月免疫组好,三组抗体水平差异非常显著(P0.01)。上述研究结果深入了防治牛皮蝇蛆病疫苗的研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用,可为田间试验提供所需抗原。


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