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专一性脱硫菌LY822的分离筛选及脱硫基因工程菌的构建

姜声华  
【摘要】:专一性微生物脱硫技术能选择地性脱除加氢脱硫技术难以脱除的芳香族含硫化合物,是实现石油及其产品深度脱硫有效的技术之一。分离筛选优良的菌株,构建高效的脱硫工程菌是提高微生物脱硫能力的重要途径。本文以此为研究目标,开展了专一性脱硫菌株的分离鉴定、脱硫基因克隆、启动子功能鉴定、表达载体和工程菌的构建以及脱硫活性评估等方面的研究。 采用以二苯并噻吩(DBT)为唯一硫源的培养基,经驯化培养,从我国山东胜利油田土样中分离到一株专一性脱硫菌株LY822。对该菌培养五天后的代谢产物高效液相色谱(HPLC)分析的结果表明,0.5mmol/L的DBT完全转化为2-羟基联苯(2-HBP),证明该菌株是“4S途径”的专一性脱硫菌。菌株形态特征及16SrDNA序列分析表明,该菌属于红球菌属进化分枝,与红平红球菌Rhodococcus erythropolis同源性最高,达到99.7%,故将该菌初步鉴定为Rhodococcus sp.LY822。 以LY822菌的质粒DNA为模板,PCR反应扩增了三个脱硫结构基因片段dszA、dszB和dszC,大小分别为1.3kb、1.0kb和1.2kb。利用表达质粒pET21a分别克隆了三个脱硫基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,全细胞蛋白电泳分析发现有相应的清晰融合蛋白条带产生。 以带有报告基因gfp的质粒pEGH和大肠杆菌-红球菌穿梭载体pBS305为出发质粒,构建了三个带有不同启动子的表达质粒pBSGt、pBSGd和pBSGk,电击转化红平红球菌LY822。激光共聚焦显微镜检测结果表明,当gfp基因受tsr(硫链丝菌肽抗性基因)启动子调控时,gfp基因的表达效率最高,而且不再受硫酸盐的抑制。 以红平红球菌LY822的质粒为模板,扩增了脱硫基因的全片段,连接于经HindⅢ-Xbal酶切的pBSGd,pBSGk,pBSGt,得到带有脱硫基因的表达载体pBSDd、pBSDt和pBSDk。分别电击转化LY822菌和吖啶橙消除质粒的LY-0菌,脱硫活性测定结果表明,tsr启动子调控的工程菌株LYDt,脱硫能力提高最显著,即使在有硫酸盐存在的条件下,脱硫活性也不受抑制。这与用报告基因得到的研究结果一致。 在实际体系柴油(硫含量497ppm)的脱硫结果表明,带有pBSGt质粒的重组菌LYDt反应4小时的脱硫率达到82%以上,高于原始菌株的61%。


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