山羊痘病毒p32基因的克隆与表达

【摘要】：山羊痘是由山羊痘病毒引起的山羊和绵羊的急性、高度接触性传染病，以皮肤和粘膜出现痘疹、持续高热、淋巴腺炎以及局部病毒性肺炎为特征。发病率高达80％，死亡率达50％。易感羔羊的发病率达100％，死亡率可达95％，近年来在我国很多地区爆发流行，给养羊业造成了巨大的损失。但目前尚无治疗本病的特效药物，最有效的防治措施就是疫苗接种，所以对本病作出及时、正确的诊断，从而防止疾病的传播蔓延就显得尤为重要。病毒囊膜蛋白P32是山羊痘病毒属成员所特有的蛋白，具有很好的抗原性，与山羊痘病毒的其他蛋白相比，能够诱导机体较早地产生抗体，且抗体水平较高。利用此蛋白作为抗原可以建立一套有效的诊断方法，也可以利用它作为亚单位疫苗进行疾病的预防。 本实验从山羊痘弱毒疫苗中提取山羊痘病毒的基因组DNA，根据GenBank上已发表p32基因核苷酸序列，设计并合成一对引物，经PCR扩增获得了全长p32基因，将p32基因克隆到pMD18-T载体并测序。结果表明，GPVp32基因全长969bp，编码322个氨基酸，将其与GenBank上已发表的p32基因序列相比对发现，其与山羊痘病毒属成员p32基因的核苷酸同源性为97.4％-99.9％，氨基酸同源性为95％-99.7％，说明p32基因在山羊痘病毒属中高度保守。经TMHMM软件分析表明，在281-303位氨基酸之间为一个跨膜区。将p32基因亚克隆到表达载体pET-30-a(+)、pGEX-6P-1及pPROEX~(TM)HTb中，分别转化感受态细胞BL21(DE3)或DH5α，并用IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析，目的蛋白在三种表达载体中均未见大量表达。鉴于原核表达的效果并不理想，本实验采用了Bac-N-Blue~(TM)杆状病毒表达系统。将p32基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA中，构建了真核转移载体pMelBacA-p32，经限制性内切酶消化、p32特异性引物PCR鉴定，证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacA-p32质粒与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-Blue~(TM)DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经三轮篮斑筛选纯化，获得了重组杆状病毒，命名为rBaculovirus-p32。提取病毒基因组DNA，经p32特异性引物和重组杆状病毒特异性引物PCR鉴定，证明成功获得了纯化的重组杆状病毒。用该重组病毒接种Sf9昆虫细胞，收获接种后不同时间的细胞，经SDS-PAGE及Western blotting分析，结果表明p32基因在昆虫细胞中获得了表达，表达的融合蛋白的分子量约为40kDa．。 本实验成功构建了含p32基因的三个重组原核表达载体，为进一步优化表达条件从而在大肠杆菌中表达P32蛋白奠定了基础。获得了含p32基因的重组杆状病毒，并在昆虫细胞中表达了P32蛋白，为P32的分子生物学研究提供了材料。