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辣椒抗病相关CaWRKY转录因子基因的分离及特性研究

李蕾  
【摘要】:植物在应对外界生物与非生物胁迫过程中获得了一系列复杂的植物防卫反应机制。这种由于自身进化而获得的防卫机制,主要是通过植物防卫反应基因的转录激活与转录抑制发生作用的。植物识别病原物后,通过一系列信号传递过程,最终诱导相关植物防卫反应基因的表达。在此过程中,转录因子起着重要的作用,它通过与其它相关蛋白之间的相互作用激活或抑制防卫基因的转录,同时,一些转录因子其自身也是受诱导调控的,改变特定的转录因了的表达条件会使植物的胁迫抗性发生很大变化。因此,转录因子在植物防卫反应基因的表达调控中起关键作用。特别是单个植物防御反应基因的超表达可增强植物对特定病原物的抵抗能力,而一个转录因子基因的超表达能够激活多个下游抗病基因的表达。因此,利用防御反应相关转录因子基因来改良植物的综合抗病性,是一条很有潜力的分子育种途径。 WRKY蛋白是一种只存在于植物体的新的转录因子超家族,其成员广泛参与了植物的生长发育、代谢以及对生物或非生物胁迫的反应,尤其是在植物抵御病原物侵害的抗病反应中具有重要的调控作用。 本研究以高抗辣椒品种为材料,利用同源克隆法在经水杨酸诱导处理的辣椒叶片中分离到6条CaWRKY基因片段,命名为Capsicum annuumWRKY,即CaWRKY1~6,其中5条为辣椒WRKY新基因。扩增得到的6条CaWRKY片段中CaWRKY2片段长度为659bp,具有两个WRKY结构域,其它5条片段都在150bp左右,只检测到一个WRKY结构域。通过对这6条CaWRKY基因进行同源与进化分析,发现其中CaWRKY1、CaWRKY2、CaWRKY3、CaWRKY4及CaWRKY6 5条基因的亲缘关系较近,而CaWRKY5与其它基因同源性较低。通过将6条CaWRKY基因的蛋白翻译序列与抗病相关拟南芥第三家族WKRY成员及茄科植物中已分离的WRKY蛋白进行进化分析,发现这6个CaWRKY氨基酸序列与拟南芥第三家族的亲缘性较低,而与茄科植物的WRKY蛋白亲缘关系接近。其中CaWRKY2、CaWRKY3、CaWRKY4、CaWRKY6与报道的抗病相关的烟草WRKY转录因子如NtWRKY1、NtWRKY2、NtWKRY4亲缘关系非常接近,因此推断CaWRKY2、3、4、6可能在植物抗病防卫反应中有相关作用。 通过同源进化分析,并由于已获得的长片段的易操作性,无论是RACE扩增中引物的设计还是杂交探针的制备都能提供更多的序列信息,因此本实验最终确立CaWRKY2为后续实验的靶标基因。对此基因进行RACE,最终获得部分3'cDNA序列,长1265bp,编码290个氨基酸。对CaWRKY2 3'cDNA序列翻译后进行分析,该WRKY基因的氨基酸序列分别在N端和C端各具一个WRKY结构域和一个C_2H_2的锌指结构,因此可推断该基因属于WRKY第一家族成员。 为进一步探索该基因在不同诱导剂诱导下的表达情况,以便揭示该基因可能参与的防卫信号途径。本实验采用半定量RT-PCR的方法及Northern验证对CaWRKY2基因的表达模式进行了初步的探索。结果表明,CaWRKY2在水杨酸及BABA诱导下表达量有明显增高趋势,在MeJA诱导下基本不表达。说明CaWRKY2基因可能参与SA信号途径。 由于前期实验中已证实CaWRKY2基因受SA及BABA诱导表达,说明该基因可能参与相关的诱导抗性反应,因此,为进一步验证CaWRKY2在生物胁迫下的表达情况,从而揭示出其相应


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