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大豆子叶异黄酮类次生代谢物的诱导及其微粒体部分蛋白的初步研究

乞永艳  
【摘要】:大豆[Glycine max(L.)Merr.]不仅可提供优质丰富的蛋白质和油脂,更是具有多种生物活性的异黄酮类化合物的重要来源。Glyceollins是大豆应激反应的主要产物,同时,它也是一种异戊二烯化的异黄酮,这类化合物生物学作用的日显突出和其分布的局限性吸引着越来越多研究者的关注。 本研究综合利用分析高效液相色谱、制备高效液相色谱、同位素标记、薄层色谱、四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF/MS/MS)、二维电泳等现代技术,将分析化学、制备化学、蛋白质分离纯化和氨基酸序列测定充分结合,研究了外源硝酸银和茉莉酸诱导处理中黄13号和“Cultivar 1”(荷兰)大豆子叶后,Glyceollins及其前体glycinol的诱导累积规律及其与其它固有的大豆异黄酮之间的联系;同时,对大豆中的异戊二烯转移酶进行了活性测定;并对硝酸银诱导后大豆子叶微粒体蛋白进行了初步研究。主要结论如下: 1、中黄13号与“Cultivar 1”对外来刺激产生应激反应的能力有所不同,与“Cultivar 1”相比,中黄13号对外界刺激更为敏感。 2、硝酸银诱导处理后,Glyceollin异构体比例不随保温时间的延长而改变;大豆苷元和染料木素含量上升,其相应的糖苷含量下降。茉莉酸处理后,Glyceollin Ⅰ和glyceollin Ⅲ所占比例下降,glyceollin Ⅱ所占比例增加;同时,游离苷元含量下降,糖苷含量增加。这表明:虽然硝酸银和茉莉酸都能够诱导大豆子叶中glycinol和glyceollins的累积,但是,其作用机制有可能不同。0.01 M硝酸银诱导glycinol和glyceollins累积的能力最强,其次依次为0.001 M和0.1 M硝酸银。10μM茉莉酸诱导glyceollins累积的能力最强,20μM~100 μM的茉莉酸诱导glyceollins累积的能力相近,1 mM高浓度的茉莉酸非但未能增强诱导glyceollins累积的能力,反而有可能在某种程度上抑制了glyceollins的累积。 3、在glycinol和glyceollins累积过程中,苯丙氨酸代谢途径中的相关化合物在发生物质转化的同时,还发生着空间上的转移。植物抗毒素glyceollins(glycinol)的累积只发生在遭遇刺激的部位;同时,该部位中与之有关的其它异黄酮浓度也高于健康部位。另外,这些化合物还存在着从健康部位向遭遇刺激部位转移的倾向,且与遭遇刺激部位垂直相连的部位有可能比与之横向相连的部位更容易与受刺激部位发生异黄酮间的转运和交换。 4、利用制备高效液相色谱,从390g(鲜重)0.01 M硝酸银诱导的大豆子叶中分离纯化出约110mg高纯度的glycinol(282μg/g鲜重),为大豆中异戊二烯转移酶的研究提供了难得的底物,并提供了一种分离纯化glycinol的有效方法。 5、利用[~3H]DMAPP和glycinol为底物进行大豆中异戊二烯转移酶活性测定。用同位素标记与薄层色谱相结合,检验并分离、制各反应产物,经Q-TOF/MS分析鉴定,反应产物为glyceollidins。文中对glyceolldins难以大量累积的问题进行了初步分析。大豆中异戊二烯转移酶活性的成功测定为该酶的进一步研究提供了可靠保证,同时也有利于其它与之相关的微粒体蛋白的研究。 6、对二维电泳技术用于硝酸银诱导后大豆子叶微粒体膜蛋白分离的条件进行了优化。结果表明:在重新水化溶液组成中,还原剂比去垢剂对膜蛋白溶解性的影响更大,还原剂三丁基膦比二硫苏糖醇效果好,去垢剂(3-(4-hepty) phenyl 3-hydroxy propyl)(dimethylammonio propane sulfonate)(C_7BZO)对蛋白质的增溶作用强于amidosulfobetaine-14(ASB-14)和


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