小麦耐盐相关基因HKT克隆及多样性与功能研究

【摘要】：土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性问题,在世界范围内引起多种作物减产。小麦(Triticum aestivum L.)作为世界重要粮食作物,与其他作物一样,土壤盐渍化严重制约着小麦的生产。运用分子生物学技术和手段研究小麦耐盐基因,不仅有助于小麦耐盐机制的研究,而且有助于耐盐小麦的培育。盐渍化土壤中Na~+和Cl~-是抑制植物生长的主要因素。但对大多数植物来说,Na~+是植物离子特异性损害的最主要原因。因此,克隆与小麦Na~+吸收有关的基因,分析这些基因在小麦中的自然变异,不仅可以了解这类基因在小麦耐盐机制中的作用,而且有助于通过传统育种或遗传工程技术提高小麦的耐盐性。 根据小麦TaHKT1(high-affinity potassium uptake transporter)cDNA核苷酸序列设计引物,从普通小麦中国春中分别克隆出TaHKT1的基因组序列和cDNA序列,通过二者的比较,确定了TaHKT1的基因结构。TaHKT1含有3个外显子和2个内含子。在38份普通小麦材料中发现5种类型TaHKT1,分别命名为TaHKT1-1、TaHKT1-2、TaHKT1-3、TaHKT1-4和TaHKT1-5。根据TaHKT1基因组序列,从不同小麦材料中分别克隆了TaHKT1-1、TaHKT1-2、TaHKT1-3和TaHKT1-4相应的cDNA序列,但未发现TaHKT1-5相应的cDNA,并且根据结构预测TaHKT1-5在N195存在1个终止密码子,因此推测TaHKT1-5可能为假基因。在小麦野生近缘种中克隆了19种TaHKT1,其核苷酸序列多样性高于普通小麦。小麦野生近缘种、地方品种和育成品种TaHKT1多样性分析表明,TaHKT1属于驯化基因。 根据小麦TaHKT1cDNA序列设计引物筛选粗山羊草(Aegilops tauschii)AL8/78 BAC文库和矮败中国春小麦BAC文库,通过单克隆BAC质粒延伸测序克隆了TaHKT2、TaHKT3以及TaHKT1、TaHKT2和TaHKT3的侧翼序列。在13份普通小麦材料中分别克隆了2种类型TaHKT2和3种类型TaHKT3,分别命名为TaHKT2-1、TaHKT2-2、TaHKT3-1、TaHKT3-2和TaHKT3-3。TaHKT2 5'-非翻译区2个碱基的缺失可能是导致该基因沉默的原因。在普通小麦莱州953中克隆了TaHKT4及其侧翼序列,在13份普通小麦材料中克隆了5种类型TaHKT4,分别命名为TaHKT4-1、TaHKT4-2、TaHKT4-3、TaHKT4-4和TaHKT4-5。根据TaHKT2、TaHKT3和TaHKT4 5'侧翼序列设计基因特异引物,以中国春缺四体DNA为模板,将TaHKT2、TaHKT3和TaHKT4分别定位于染色体7D、7B和7A。 根据水稻SKCI(Shoot K~+ Content)对应的小麦EST序列设计引物,筛选粗山羊草AL8/78 BAC文库,测序获得粗山羊草AL8/78 AeSKC1,进一步克隆了普通小麦中国春TaSKC1。在27份普通小麦材料中仅发现TaSKC1-1和TaSKC1-2 2种类型TaSKC1,二者仅在第一内含子存在1个碱基的转换。在14份地方品种和13份育成品种中发现均仅含有TaSKC1-1和TaSKC1-2。从8份小麦合成双二倍体(染色体组为ABD)中克隆了5种TaSKC1,其中3种与普通小麦TaSKC1不同。小麦合成双二倍体、地方品种和育成品种TaSKC1的多态性研究表明,TaSKC1在驯化过程中存在明显的瓶颈效应,属于驯化基因。根据小麦TaSKC1设计引物筛选矮败中国春小麦BAC文库,获得小麦TaSKC2及其侧翼序列,在12份普通小麦材料中发现2种类型TaSKC2,分别命名为