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犬蝠源呼肠孤病毒的分离鉴定及其生物学特性的研究

冉旭华  
【摘要】:将30份广东省韶关市送检的野生犬蝠样品,研磨后接种Vero-E6细胞,从中分离到2株病毒。其中一株在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。反复冻融3次后,收集细胞及培养液,电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,呈正二十面体对称,将病毒命名为Bat/China/2003(B/03)。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞,不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力;能耐受pH3.0的酸性环境;50℃水浴1h病毒丧失感染能力;1M Mgcl_2能提高病毒对热的抵抗力,增强病毒的活性。病毒基因组经琼脂糖凝胶电泳分大、中、小3个区段。用哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST分析表明,与呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的Ndelle virus(NDEV)核苷酸同源性最高为91.2%。用DNAMAN Multiple Alignment进行序列同源性分析,与MRV血清1、2、3型的代表株T1L、T2J、T3D的核苷酸同源性分别为89.9%、76.9%、89.9%。以上结果证明该病毒为呼肠孤病毒科的成员。 采用RT-PCR方法,测定犬蝠源呼肠孤病毒B/03株全基因组10个基因节段完整ORF序列。使用分子生物学软件对其核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析,绘制系统发生进化树,并分析各基因编码产物的功能区与结构域,从而预测各蛋白的功能。根据B/03株编码的蛋白和呼肠孤病毒科其它成员编码蛋白的比较结果推测,B/03株的L1、L2、L3、M1、M2、S1、S2、S4基因分别编码病毒的结构蛋白λ3、λ2、λ1、μ2、μ1、σ1、σ2、σ3,而M3、S1、S3基因编码病毒的非结构蛋白μNS、σ1S、σNS(S1基因编码两种蛋白,结构蛋白σ1和非结构蛋白σ1S)。 对功能性结构域的分析表明,λ3蛋白氨基酸序列中含有RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)的保守区,推测是病毒的RdRp。λ2蛋白有鸟苷转移酶和甲基化酶的活性区,推测可能在病毒复制时mRNA的帽化过程中起作用。λ1蛋白的N-末端发现了锌指结构和RNA螺旋酶的保守区,推测λ1蛋白具有dsRNA连接活性和ATPase活性。μ2蛋白含有两个NTP-binding基序,这表明它可能具有核苷三磷酸酶活性。μ1蛋白的C-末端有4个大的亲水区,都位于蛋白的表面,可能形成环和折叠,而且抗原性较高,推测有可能引起宿主细胞的免疫反应。σ1蛋白的N-末端有一个连续的能形成alpha-helical coiled coils结构的七肽重复序列(a-b-c-d-e-f-g)_n,该区域可能与病毒的血凝活性有关。同时还发现,σ1蛋白有4个潜在的糖基化位点,推测σ1蛋白可能是糖基化的蛋白,与病毒的吸附有关。σ2蛋白的C-末端有一个双亲性的α-螺旋,它与大肠杆菌的DNA依赖性RNA聚合酶的β亚基非常相似,推测具有dsRNA连接活性。σ3蛋白的N-末端有锌指结构域,C-末端有dsRNA连接区。μNS蛋白的C-末端发现了七肽重复序列能形成alpha-helical coiled coils结构,推测这种结构有利于该蛋白与细胞骨架的连接。在μNS蛋白的N-末端还发现了ATPase的保守区,预示其可能具有ATPase活性。σ1S蛋白富含碱性氨基酸和α-螺旋,有一个潜在的糖基化位点,但其功能尚不清楚。σNS蛋白富含Cys残基和α-螺旋,推测可能具有ssRNA连接活性。


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