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鸡源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因重组腺病毒活载体疫苗研究

周继章  
【摘要】:本研究分离了鸡源鹦鹉热衣原体,建立了鸡衣原体病PCR诊断方法。利用E1和E3缺失的人腺病毒5型载体,首次在国内外成功构建了含有鸡源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因的重组腺病毒。并用重组腺病毒对本动物鸡进行了免疫试验和安全试验。 (1) 从疑似患鹦鹉热衣原体病鸡分离到衣原体,经涂片观察、接种鸡胚,碘染色试验、磺胺嘧啶钠试验、电子显微镜观察,确定为鹦鹉热衣原体,命名为hnq株,用鸡胚法测定其毒力为1.8×10~(-7)/0.2ELD_(50),CpL株的毒力为5.6×10~(10)/0.2 ELD_(50)。选择CpL株为研究对象。建立了鸡源鹦鹉热衣原体PCR诊断方法,并对其特异性、敏感性和灵敏度进行了验证。 (2) 对鸡源鹦鹉热衣原体CpL株MOMP基因进行了克隆和测序,并与禽源鹦鹉热衣原体其他菌株的MOMP基因进行了序列比较。结果表明,与禽源衣原体鸭(GD)株的MOMP氨基酸序列同源性为89.7%;与火鸡(CT1)株MOMP氨基酸序列同源性为88.7%;与鸽子(CP3)株MOMP氨基酸序列同源性为82.3%;与长尾小鹦鹉(VS225)株的MOMP氨基酸序列同源性为94.4%。 (3) 通过基因操作的方法,将鸡源鹦鹉热衣原体CpL株MOMP基因置于腺病毒穿梭载体的巨细胞瘤(CMV)启动子和SV40 Poly(A)尾巴之间,构建成目的基因的表达盒。构建的穿梭载体与腺病毒骨架载体在BJ5183工程菌内进行同源重组,筛选阳性重组腺病毒质粒,命名为Ad-MOMP。序列测定表明,Ad-MOMP重组腺病毒所带的鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因的氨基酸序列完全正确。转染HEK293细胞,用间接免疫荧光对表达产物检测,证明所构建的重组腺病毒能正确表达目的基因。减蛋综合征(EDS_(76))阳性血清中和试验表明,不能中和重组腺病毒。重组腺病毒稳定性试验表明,该重组病毒能稳定携带外源基因进行传代(23代)。 (4) 禽源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒免疫SPF小鸡,第21天测定抗MOMP抗体,达到1:32,用6.8×10~9TCID_(50)免疫SPF小鸡。能够抵抗5.6×10~10ELD_(50)同源强毒CpL株的攻击获得保护,保护率达9/10;用减蛋综合征病毒(EDS_(76)V)检测重组腺病毒抗体,表明二者无抗原—抗体交叉反应。用野生型腺病毒和HEK293细胞免疫的对照组均未产生任何的免疫保护效果。肌肉与皮下两种免疫途径试验结果表明,二者基本无差别,考虑到田间免疫的实用性,选择肌肉免疫。 (5)根据SPF小鸡免疫攻毒试验结果,用6.8×10~9TCID_(50)重组腺病毒一次肌肉免疫7日龄小鸡,21天后用同源强毒CpL株进行攻击,观察结果6个月,表明免疫小鸡能够抵抗1.1×10~10ELD_(50)鹦鹉热衣原体强毒的攻击,保护率达8/10。对照组10只鸡剖检后全部表现出鹦鹉热衣原体症状。抗体持续期试验表明,免疫后21天抗体水平达到最高(1:64),随后开始逐渐下降,至180天时,抗体水平仍然维持在保护水平。应用衣原体IHA和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测了小鸡的体液免疫和细胞免疫,表明二者都有应答。重组腺病毒安全性试验表明,小鸡生长正常,无排毒现象。重组腺病毒保存期试验显示,-20℃保存1年后 该重组腺病毒滴度有所下降,但不影响免疫力。


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