油菜开花时间变异分析和拟南芥晚开花突变体鉴定与基因克隆

【摘要】：开花时间决定植物生殖发育的时期和质量,是重要的发育性状。开花时间性状受光温等环境因素调控,一般由多基因控制,存在位点的多态性。研究油菜开花时间多态性及相应控制基因有助于培育适应不同季节和轮作方式的品种。本研究包括油菜开花时间变异与AFLP分析,拟南芥T-DNA插入突变体的筛选与晚开花基因克隆。 在2003～2005两年间利用已培育的78份油菜开花时间变异广泛的品系(甘蓝型油菜70份,白菜型油菜4份和芥菜型油菜4份),于武汉和西宁两地秋播和夏播,观察油菜开花时间变化规律,并利用AFLP技术检测了油菜开花时间变异的分子多态性。获得的结果如下: 1、78份油菜材料在武汉两年秋播的开花时间变化极显著,两年夏播的开花时间变化不显著。通过分析日平均气温、积温、日照时数和日照总时数等环境影响因子,发现武汉两年秋播开花时间差异大的原因是两年的气温差异较大所致。 2、通径分析发现武汉秋播条件下从播种到开花期油菜所需积温差异是导致开花时间变异的主要原因,其它环境因子是通过积温而影响开花的。 3、选取22对选择性引物组合对78份油菜品系进行了AFLP分析。一共扩增出1323条扩增带,平均每个引物扩增53条带。经方差分析,得到137条与两年两地油菜开花时间都相关的AFLP条带。经聚类分析,将78份油菜分成5类:第1类是1～2月上旬开花的材料;第2类仅1份材料,表现特殊;第3类为2月中旬开花的材料;第4类是2月中下旬到3月上旬开花的材料;第5类为3～4月份开花的材料,全为白菜型和芥菜型油菜。 本研究的第二部分是筛选拟南芥突变体,鉴定克隆开花时间突变的基因。所筛选的拟南芥突变体库系用IGDB-XVE-Tagging载体系统构建的T-DNA插入突变体(野生型为Col-0生态型)。拟南芥突变体植株的筛选在人工生长室内进行,共筛选观察了51660个T3代突变体单株,发现了4株晚开花突变体表型,并且为PCR阳性。对其中一个株系AT2-4的进一步研究结果如下: 1、株系AT2-4从播种到开花的天数变幅为34～72天,平均为51天,野生型的变幅为30～33天,平均为32天。southern杂交结果表明,其T-DNA为单拷贝插入,因此推断该插入功能失活突变体株系的上代单株为杂合体,且为一个插入突变位点。 2、利用TAIL-PCR方法克隆了该晚开花突变体的插入位点基因的侧翼序列。将这个片段回收、测序、去掉载体序列后得到拟南芥基因组中T-DNA插入左侧侧翼序列,长度是798bp。 4、通过生物信息学分析,发现T-DNA是插入到AT5G24290基因中,该798bp的侧翼序列和AT5G24290基因对应序列相似性为100%。没有发现序列有对应的并经过实验研究的功能,仅发现该插入功能失活的AT5G24290基因的推定功能为膜整合蛋白:该基因与酵母CCC1基因的序列相似性为63.9%。酵母CCC1基因是调节Ca~(2+)含量的基因,因此推断At5g24290基因的功能可能是通过Ca~(2+)信号途径或调节细胞Ca~(2+)含量而影响开花,并且和细胞膜有关。这是首次发现植物开花时间通过Ca~(2+)信号途径或细胞Ca~(2+)含量调控,尽管需要进一步通过转基因深入研究验证。