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披碱草属遗传多样性、P基因组特异重复序列克隆和小麦EST-SSR标记开发

李斯深  
【摘要】: 本报告分为三部分。 第一部分是披碱草属植物的遗传多样性分析。以中国境内的披碱草属物种为研究材料,采用ISSR和SSR标记技术,比较了ISSR和SSR标记在披碱草属植物研究中的可应用性;研究了Elymus dahuricus complex物种在中国境内的遗传多样性状况;采用SSR标记对披碱草属植物模式种E.sibiricus的遗传多样性分布状况进行了分析。主要结果如下:(1)ISSR和SSR标记在披碱草属物种中标记效率比较研究表明,2种标记均表现出较高多态性,基于两种标记的种间聚类状况与物种的倍性水平和形态学相似程度存在较高一致性。在12个种间ISSR标记表现出更高的标记效率,SSR标记则更适于近亲缘物种分析。两种标记的相关性在12个种间表现为显著,在近亲缘水平表现不显著。(2)利用ISSR和SSR标记分析了中国境内4个E.dahuricus complex物种共39个居群的遗传多样性。结果显示,4个E.dahuricus complex物种间分化程度较低。其中Eexcelsus相对独立;E.dahuricus和E tangutorm之间存在一定程度的分化;E.cylindricus介于E.dahuricus和Etangutorm之间。UPGMA系统聚类具有明显的地域特性。其中,青海省东沿及周边地区可能是E.dahuricus complex物种在中国境内发生显著分化的地理分界线。(3)6个E.sibiricus居群的SSR分析表明,在居群内和居群间均存在较为丰富的SSR位点变异。遗传变异主要存在于居群间,居群内SSR位点以杂和状态出现的极低频率,表明E.sibiricus为较严格白花授粉植物。E.sibiricus主要分布区的40个居群研究表明,居群间分化具有明显的地域特性,其中青藏高原地区为E.sibiricus分化状况较为复杂的地区。 第二部分是P基因组特异重复序列的克隆。以冰草及小麦族其它基因组植物为材料,进行冰草P基因组特异重复序列分离研究,获得的主要结果如下:(1)利用回收特异RAPD片段的方法,分离到一个长578bp的冰草P基因组特异DNA重复序列——OPC08_(578),与Genbank上注册的序列同源比较表明,该序列是冰草P基因组新的特异重复序列。以OPC08_(578)克隆作探针进行Southern杂交表明,该克隆片段在W、H和F基因组也有分布,在ABD、R、V、E、St、Ns、I、D、A等基因组中则无分布。根据OPC08_(578)序列,设计合成了一对特异引物SC-OPC08。该标记可以用来区别P与ABD、R、V、E、St、W、Ns、D、A、C、S、U、I、M、AG基因组,也可用于小麦——冰草附加系中冰草染色质的检测,PCR扩增结果和Southern杂交结果相吻合。(2)利用回收特异ISSR片段的方法,分离到一个长535bp的冰草P基因组特异DNA重复序列——UBC811_(535),同源比较表明,该序列是P基因组新的特异重复序列。Southern杂交表明,该克隆片段在P基因组有非常强的分布,而子ABD、F、V、H、Ns、R、St等其它基因组无杂交信号。根据UBC811_(535)序列,设计合成了一对特异引物SC-UBC811,该标记可以用于小麦——冰草附加系中冰草染色质的检测。 第三部分是EST-SSR标记的开发和作图。利用普通小麦EST数据库(GenBank/dbEST)中最新的151695条EST序列(2003.7.14~2004.8.24)进行了微卫星序列的筛选,共发现微卫星序列2038个,占整个EST数据库的1.34%。根据筛选得到的微卫星序列设计并合成了249个引物对。PCR扩增表明,166个引物对在不同小麦品种中显示出稳定清晰的带型,可以作为小麦和相关物种的新的EST-SSR分子标记。将其中的93个引物对、193个位点定位到除4A和4B外的19条特定的染色体。利用RIL群体将43个EST-SSR位点绘制到遗传图谱的11条染色体上。对开发的166个EST-SSR引物对的EST在GenBank数据库进行比对分析,有48条EST序列与35种具有生物功能的核酸或蛋白质有同源性,大部分的同源产物来源于普通小麦和栽培水稻。将其中的23条EST序列、推测编码20种蛋白质的基因定位到14条特定的小麦染色体;将涉及5种推测蛋白质基因的12个位点绘制到遗传图谱的6条染色体上。


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