植物耐盐转基因研究

【摘要】： 土壤盐渍化对农林业的影响是一个全球性的问题，全球20％的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁，所以植物抗盐育种一直是研究热点。采用传统的方法选育耐盐碱的植物品种固然简便可行，但进展缓慢。随着分子生物学技术的发展，从盐生植物中分离出抗盐基因，导入林木，获得抗盐品种；况且林木由于其较长的幼年期，常规育种有明显的局限性，而通过转基因可以在较短时间内获得高抗盐品种，缩短育种周期，因此开展林木抗盐育种具有重要的意义。 参考前人在林木组织培养工作成果和美国枫香组织培养体系，我们对影响中国枫香培养体系的各种因子进行系统分析，建立了中国枫香愈伤组织诱导培养、不定芽诱导培养以及生根诱导和移栽的技术体系，为中国枫香分子育种奠定基础。研究发现1／2MS基本培养基是比较适合于中国枫香的基本培养基，经过优化的组织培养参数为：以下胚轴为愈伤组织诱导的外植体；以添加3.0mg．L~(-1)6-BA和0.5 mg．L~(-1)NAA的1／2MS基本培养基为愈伤组织诱导培养基；添加6-BA 1.0 mg．L~(-1)和NAA 0.1 mg．L~(-1)的1／2MS基本培养基为不定芽分化培养基。中国枫香生根比较容易，在WPM基本培养基中添加2.0 mg．L~(-1)的IBA，培养两周后即可生根，中国枫香移栽也比较容易，但移栽后水肥管理要求相对严格，移栽成活率可达95％以上。 中国枫香对卡那霉素比较敏感，培养基中添加25 mg．L~(-1)的卡那霉素培养2w后外植体全部死亡。5×浓度的农杆菌比较适宜于中国枫香转化，转化效率相对较高，且共培养期间和选择培养期间农杆菌生长可以得到有效抑制。 为了避免组成型启动子对转基因植株生长发育的影响以及对转基因植株光合产物的浪费，根据GENBANK上公布的序列，我们设计引物从拟南芥(Colombia生态型)中克隆了控制植物对干旱、低温和盐碱胁迫反应的诱导型启动子Rd29A基因，该基因全长891bp，含有2个DRE反式作用元件。利用该启动子以及中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室保存的pBin438质粒，我们构建了由该启动子引导的含有Ω翻译增强子和MCS叶绿体小亚基转运肽(由台湾中央研究员植物研究所胡秀敏博士赠送)的新型质粒pBinRd29A，利用农杆菌介导法进行转化，获得了转基因中国枫香阳性植株17株，耐盐转基因烟草阳性植株28株，其中转基因烟草能够正常生长发育，开花，已经获得了转基因植株的T_1代种子。对转基因植株中外源基因检测结果表明，外源基因已经整合到转基因阳性植株基因组中。对转基因烟草T_1代种子进行卡那霉素抗性检测，外源基因的遗传符合3：1分离比假设，说明了转基因植株基因组中外源基因为单位点插入。在转基因烟草生长发育过程中，发现转基因烟草顶部叶片边缘有卷曲现象。对转基因烟草T_1代种子利用不同浓度NaCl进行胁迫处理，发现在0.2～0.8％盐胁迫范围内，转基因烟草T_1代发芽率没有显著差异，但胁迫条件下其根系生长显著小于对照，说明外源基因表达在一定程度上提高了转基因植株的耐盐性。