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棉花双隐性细胞核雄性不育系与保持系花粉发育期差异表达基因分析

马小定  
【摘要】: 在棉花杂种优势利用中,细胞核雄性不育(Genic Male Sterility,GMS)系已被广泛应用于杂交种的生产,其突出的优点是败育彻底,恢复源广泛,易于筛选高优势杂交组合。利用杂交、回交转育等方法,在ms5ms5ms6ms6双隐性核不育系基础上已培育出多种可供生产利用的不育系,而且已经选育出多个杂交棉品种。但是,到目前为止,系统地对棉花细胞核雄性不育分子机理的研究却很少。所以为了更好的利用细胞核不育材料,需要对其进行深入的研究。本实验以棉花ms5ms5ms6ms6双隐性细胞核雄性不育系与保持系(ms5ms5ms6ms6A,不育系;ms5ms5ms6ms6B,保持系)为研究对象,利川cDNA-AFLP(cDNA amplified fragment length polymorphism)技术对不育系和保持系花粉发育不同时期差异表达的基因进行分析,以期得到与育性相关的转录片段,进而探讨控制育性的分子机理。取得的实验结果和主要结论如下: 1.通过对棉花花粉母细胞发育进程的细胞学观察,确定了棉花ms5ms5ms6ms6双隐性细胞核雄性不育系和保持系外部形态与花粉发育时期的相关关系,即当花蕾长度<3.0mm时,花粉处于初生造孢细胞时期;当花蕾长度为3.0-4.6mm时,处于花粉母细胞时期;当花蕾长度>4.6mm时,处于花粉粒时期。 2.应用cDNA-AFLP对不育系和保持系花粉发育的三个时期——初生造孢细胞时期、花粉母细胞时期和花粉粒时期的基因表达进行了对比分析,共筛选了64对引物组合,每条泳道平均可以扩增20个条带左右,共扩增出1,300个条带;10对引物组合具有多态性,可以重复扩增得到的差异片段有48个,经反向Northern杂交验证,15条片段结果为阳性。 3.选择15条差异表达片段和2条无差别的条带进行克隆、测序和Blast分析后发现,其中的14条片段可以在NCBI数据库中找到同源序列,功能分析表明这些片段所编码的基因可能参与了信号转导、转录、能量代谢、细胞壁发育等相关过程,其余的3条片段没有同源性或功能未知,可能是与棉花雄配子发育相关的新基因。 4.在保持系中发现了与玉米T型细胞质雄性不育恢复因子(RF2)基因同源的育性恢复因子类基因(EST编号为0603),该基因仅在保持系花粉粒时期表达,而在不育系整个花粉发育过程中都不表达。推测,rf2基因的沉默可能导致了花粉的败育。Northern杂交结果证明0603的表达模式与cDNA-AFLP结果吻合,由此也进一步验证了cDNA-AFLP结果的可靠性。


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