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PAHs降解菌的筛选、降解基因克隆及作用效果

李全霞  
【摘要】: 多环芳烃降解菌的筛选一直是国内外生物降解PAHs的一个重要方面,获取高效降解PAHs的菌株是生物修复的前提。本论文从长期污染的土壤中筛选到两株降解多环芳烃的分枝杆菌,对其进行了固体平板,摇床培养和污染土壤中的降解效果研究,结果表明这两株菌均有很强的降解能力。根据已报道的多环芳烃降解菌的双加氧酶同源序列设计引物,PCR扩增出编码双加氧酶大亚基和小亚基的基因片段,为了进一步研究多环芳烃降解基因,构建了降解菌的粘粒基因组文库,并筛选到携带降解基因的克隆子。 利用平板升华法从103个多环芳烃污染的土壤样品中初筛到51株多环芳烃降解菌。比较降解菌降解圈的大小,得到2株降解能力较强的菌,命名为M11和M16。两株菌均能以苊、芴、菲、蒽、荧蒽和芘为唯一碳源和能源良好生长。通过形态观察、生理生化特征测定、全细胞脂肪酸分析、16S rDNA序列分析和ITS序列分析鉴定这两株菌都属于分枝杆菌属(Mycobacterium),但为不同的种。 菌株M11和M16在固体平板上和液体培养基中都有很好的降解效果。在固体平板上,菌株M16降解菲(1.24×10~(-2)mg/d)和荧蒽(0.09×10~(-2)mg/d)的速率大于M11的速率(分别为0.76×10~(-2)mg/d和0.04×10~(-2)mg/d),而降解芘的速率(1.00×10~(-2)mg/d)却小于菌株M11(1.57×10~(-2)mg/d)。在液体培养基中,菌株M11和M16在5d时对200mg/L菲的降解率达到98%,16d对难降解的芘的降解率达到80%,对荧蒽的降解率为50%左右。降解菌M11在含芘50mg/L、100mg/L和200mg/L的无机盐液体培养基中培养16d降解率分别达到76.9%、91.8%和79.23%,在芘浓度100mg/L,pH为5~9的液体条件下,均可生长和降解,添加高浓度的葡萄糖会抑制降解能力。 添加氮源和磷源对菌株在污染土壤中的降解效果有一定的促进作用,添加无机钾对降解效果有一定的抑制作用。盆栽条件下,降解菌株与植物联合的作用效果较好,降解效率较高。从开始接种到第4周这段时间的降解速度较快,之后变慢。接种菌剂比不接种菌剂的降解效果好,土壤不灭菌比灭菌的降解效果佳。植物的根和茎叶对芘有一定的吸收作用,不接种菌剂的处理比接种的吸收的较多,土壤中接入菌剂后,植株芘的含量明显降低,不灭菌土壤植株芘的含量相对高于灭菌土壤。 根据已报道降解菌的双加氧酶同源序列设计引物,PCR扩增出编码双加氧酶大亚基和小亚基的基因片段,序列分析表明与已知降解芘的分枝杆菌的双加氧酶基因nidA和nidB具有99%的同源性。利用粘粒pLAFR3作为载体,制备基因组DNA部分酶切片断,经体外包装、转染大肠杆菌DH5a,在选择培养基平板上获得1万多个重组克隆子,构建了菌株M11的基因组粘粒文库。从含菲的固体培养基上筛选到了携带降解基因的克隆子,经PCR扩增,所有克隆子均带有nidA基因。


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