收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

共轭亚油酸高转化量菌株筛选及其酶学性质研究

王丽敏  
【摘要】: 共轭亚油酸(CLA)是含有共轭双键的亚油酸(LA)各种异构体的总称,由于其令人瞩目的生理功效,已成为国内外研究的焦点。本实验从乳制品常用发酵剂入手,探索一条通过菌株筛选,亚油酸异构酶的分离纯化以及酶促工艺研究为主要线索的CLA生物合成的途径。本论文的主要实验结果如下: 实验采用气相色谱(GC)和紫外分光光度(UV)相结合的方法测定标准品中CLA的含量。结果表明:两种方法测定的已知浓度CLA的含量符合方程:y=4.15+300.16/(1+10~(2.96-0.04x))(其中x为UV测定的CLA含量,y为GC方法测定的CLA含量)。通过对拟合方程的验证,结果表明在16.93~61.49μg/mL范围内,样品经拟合方程换算的浓度与GC测定结果相近。UV法是一种可以快速、准确地测定发酵液中CLA各异构体总量的检测方法。 P.freudenreichii发酵液中CLA的主要异构体为c9,t11-CLA和t10,c12-CLA,在乳酸钠、MRS和脱脂乳三种培养基质中,P.freudenreichii ssp.shermanii和P.freudenreichii ssp.freudenreichii均具有生成CLA的能力。菌液浓度(OD_(600))为1,葵花籽油浓度12 mg/mL,接种量2%(v/v),30℃微氧培养36 h,P.freudenreichii ssp.shermanii转化生成CLA量最大为78.790μg/mL,转化率为0.66%,微氧条件有利于CLA的生成与积累。在三种培养基质中葵花籽油对两株菌的生长均有明显的抑制作用,抑制作用的强弱与CLA的生成量成反比。 24株实验室保存的乳酸菌中7株具有转化葵花籽油中LA生成CLA的能力。经传统的分离纯化方法和API 50 CHL乳酸菌鉴定系统,确定具有CLA生成能力的菌株分别为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum);唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis ssp.lactis),其中L.plantarum转化生成CLA的能力最强。在脱脂乳培养基中,L.plantarum菌液浓度(OD_(600))为1,葵花籽油浓度6mg/mL,接种量2%(v/v),37℃微氧培养12h,L.plantarum转化生成CLA量最大为103.366μg/mL,转化率为1.72%。有氧和微氧条件下L.plantarum转化生成CLA的能力相同,但微氧条件有利于CLA含量的保持。 采用盐析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析,DEAE Sepharose F.F.离子交换层析对来源于L.plantarum和P.freudenreichii ssp.shermanii亚油酸异构酶进行提取纯化的研究并分别建立了分离提取步骤及其酶学特性的研究。P.freudenreichii ssp.shermanii亚油酸异构酶的最适pH值为8.0,最适反应温度是30℃,K_m=20.53μM,V_(max)=0.44μg/mL.min,分子量约为56 kDa;L.plantarum亚油酸异构酶的最适pH值为7.5,最适反应温度是为50℃,K_m=17.85μM,V_(max)=0.73μg/mL.min,分子量为50.65 kDa。 通过高效液相色谱(HPLC)与电喷雾离子化/质谱(ESI-MS)相结合的方法得到了L.plantarum和P.freudenreichii ssp.shermanii亚油酸异构酶的氨基酸序列。结果表明来源于L.plantarum和P.freudenreichii ssp.shermanii亚油酸异构酶(sample1)的全氨基酸序列不同,但两者具有一定的同源性。在谱库中检索到与本实验得到的亚油酸异构酶最接近的蛋白分别为3磷酸甘油脱氢酶和一种膜结合蛋白,因此本实验得到的亚油酸异构酶不同于已经报道的异构酶。 L.plantarum亚油酸异构酶催化LA生成CLA的转化率比L.plantarum菌株转化葵花籽油中的LA生成CLA的转化率高,在不同条件下CLA生成量的顺序为超临界>微氧条件>有氧条件。通过超临界状态下对L.plantarum亚油酸异构酶催化LA生成CLA过程单因素和三因素二次通用旋转组合设计实验,得到了最优的酶催化法生成CLA的条件为:反应时间1h,反应温度46.4℃,压力为25 MPa,在此条件下CLA含量为0.93 mg/mg蛋白,转化率为32.89%。 从本文结果可以看出,L.plantarum具有较强的转化生成CLA的能力,在超临界条件下在较短时间内即可得到较高的CLA转化率,因此L.plantarum亚油酸异构酶具有广阔的研究价值和发展前景。


知网文化
【相似文献】
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 杨鹏标;王加启;周再勇;陆永国;;富含共轭亚油酸(CLA)奶牛的个体选择、营养调控和科学管理[A];中国奶牛协会2007年会论文集(上册)[C];2007年
2 徐文;海春旭;杨晨;李嘉琳;王鹏;;CLA对实验2型糖尿病大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性及氧化应激的影响研究[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 王丽敏;共轭亚油酸高转化量菌株筛选及其酶学性质研究[D];中国农业科学院;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前6条
1 魏仲珊;发酵法和添加法生产富含CLA的液态奶工艺技术研究[D];湖南农业大学;2007年
2 张文斌;共轭亚油酸对肥胖大鼠及糖尿病大鼠的影响及其机制研究[D];第四军医大学;2005年
3 孔燕;共轭亚油酸对2型糖尿病大鼠的影响及其机制研究[D];第四军医大学;2006年
4 曹子鹏;侧脑室注射共轭亚油酸(CLA)的外周效应研究[D];第四军医大学;2007年
5 赵树法;CLA混合物、异构体活性及FFA型与TG型CLA活性的差异比较研究[D];中国海洋大学;2009年
6 侯祥红;共轭亚油酸对HepG2细胞脂质代谢的影响及其机制研究[D];第四军医大学;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978