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流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因组序列分析及E蛋白抗原表位鉴定

闫丽萍  
【摘要】: 流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一种以蚊虫为媒介传播的人和动物共患的病毒性疾病,对人类危害巨大,是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一,对猪可引起繁殖障碍,给养猪业造成巨大的经济损失。猪是JEV的中间宿主,带毒猪是本病的主要传染源。因此,控制猪的JE不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。 本研究首先根据已发表的JEV SA14-14-2株基因序列设计合成了4对引物,通过RT-PCR从乙脑病毒SA14-14-2株经BHK21细胞传至第20代的毒株SA14-14-2-B20中扩增得到了覆盖乙脑病毒基因组全长的4个cDNA片段,将所得片段克隆至pMD18-T载体上,经测序和拼接后,获得了JEV基因组全序列(SA14-14-2-B20)。序列分析表明,该JEV基因组全长10 977bp,含有1个大的开放阅读框架,编码1个由3 432个氨基酸残基组成的聚合蛋白,其5’非编码区和3’菲编码区分别由95和583个碱基组成。将此全序列与SA14源病毒株核苷酸、氨基酸进行比较,同源性均在99%以上,突变位点分散于各个区域,而且发现SA14-14-2-B20一些位点和SA(A)及野毒株SA14核苷酸、氨基酸序列相同而与疫苗株SA14-14-2不同,推测这些区域可能与减毒没有关系。发现SA14-14-2-B20在3’非编码区第10 701位插入一个碱基G。比较了31株JEV全序列的3’非编码区,结果提示10701位碱基G插入区域可能是JEV易变位点。将SA14-14-2-B20序列与GenBank发表的31株JEV全序列进行同源性分析,以进一步了解JEV之间的遗传进化关系。本研究所获得的SA14-14-2-B20株全序列测定,一方面有助于揭示病毒的致病和减毒机理,另一方面也为减毒活疫苗生产的质量控制,主要为监控可能发生的回复突变提供分子基础。此外,病毒基因组全序列cDNA克隆的建立为进一步进行感染性克隆的研究奠定了基础。 E蛋白是JEV的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。本试验通过PCR扩增EF1(1~291aa)、EF2(292~402aa)和EF3(403~500aa)3个片段,PCR产物分别定向克隆到表达载体pGEX-6p-1中,经诱导各融合蛋白均以包涵体的形式表达。兔抗SA14-14-2病毒血清的ELISA和Western blot结果均表明EF1和EF2片段1~402aa是E蛋白的免疫优势决定区。为对这一免疫优势区域进行抗原表位鉴定,设计一套52个部分重叠的短肽,这些短肽覆盖全部1~402aa片段。将每一个短肽基因序列分别合成一对寡核苷酸链,退火后插入表达载体pGEX-6p-1,与GST进行融合表达,多数表达的融合蛋白以可溶解的形式存在。用JEV阳性血清进行Western blot和ELISA扫描,鉴定出11个抗原表位,分别为E1(1~16 aa)、E10(73~88 aa)、E11(81~96 aa)、E19(145~160 aa)、E33(257~272aa)、E39(305~320 aa)、E45(353~368 aa)、E47(369~384 aa)、E48(377~392 aa)、E49(385~400aa)和E63(373~388 aa)。通过Western blot蛋白免疫印记对鉴定的抗原表位进行精细分析,最终确定为9个抗原表位:E1(1~16 aa)、E10-4(77~84 aa)、E11-2(83~94 aa)、E19(145~160 aa)、 E33(257~272 aa)、E39-2(309~316 aa)、E45-3(359~362 aa)、E48-1(377~384 aa)、E49(385~400aa)。应用此9个融合蛋白对小鼠进行免疫,结果表明9个融合蛋白均能诱导小鼠产生针对短肽的特异性抗体。且通过中和试验鉴定出E10(73~88 aa)、E39(305~320 aa)为线性中和表位。其中表位E10与现有的报道区域重替,另一个中和表何E39为新确定的。将鉴定的表位合成多肽,混合包被ELISA板,证实可以用于检测猪血清。本研究对JEV SA14-14-2株E蛋白进行抗原表位的鉴定,将有助于进一步阐明E蛋白的结构与功能,将为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法和基于表位疫苗的设计研究提供重要的研究工作基础。


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