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牛流行热病毒糖蛋白G_1抗原表位的表达及重组G_1蛋白抗原间接ELISA方法的建立

郑福英  
【摘要】: 牛流行热(bovine ephemeral fever,BEF)是由牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV)引起的一种急性传染病,首先发现于19世纪中期的东非,随后流行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区。该病传播迅速,流行面广,有一定的周期性,曾在我国多个省份多次发生,导致奶牛产奶量降低,乳品质下降,役用牛跛行或瘫痪,部分怀孕母牛流产,给养牛业造成重大经济损失。 BEFV有5种结构蛋白,其中G蛋白是主要的免疫原性蛋白,其表面存在5个抗原位点,G_1为BEFV所特有,只与牛流行热病毒阳性血消发生反应,而其它位点与同科的相关病毒则存在交叉反应,因此我们选取G_1抗原表位进行克隆表达和蛋白纯化。将得到的重组G_1蛋白作为包被抗原,建立检测BEF血清抗体的间接ELISA方法,开发相关的试剂盒,为该病的快速诊断和疫苗免疫后的抗体水平监测提供技术支持。 本研究从BEF中国标准毒株JB76H株中提取总RNA,通过RT-PCR方法扩增G_1抗原表位目的基因。序列分析发现,克隆的G_1抗原表位基因与NCBI/GenBank上登载的台湾株的核苷酸同源性为96.4%,氨基酸同源性为96.5%;与澳大利亚株的核营酸同源性为89.1%,氨基酸同源性为90.8%。 目的基因在GS115中得到胞外分泌的可溶性目的篮白,蛋白大小约为26.0kDa;在BL21(DE3)中得到主要以包涵体形式存在的重组蛋白,蛋白大小约为41.54kDa。经SDS-PAGE、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析,两种蛋白均具有良好的反应原性、免疫原性和特异性,可作为包被抗原,建立ELISA方法。 以BL21(DE3)表达的重组蛋白作为包被抗原,经过各种反应条件的优化,建立了检测BEFV血清抗体的间接ELISA方法。本研究表明,抗原的最适包被浓度为0.574μg/孔;血清和酶标抗体的最佳稀释度分别为1:20和1:200;抗原包被后以37℃1h转入4℃过夜包被效果较好;封闭后以37℃1h、血清加入后以37℃1h、酶标抗体加入后以37℃1h反应,为ELISA最适反应温度和间隔时间。判定标准为:标准阴性血清对照孔OD_(490)值的平均值×2.1作为闽值,所测样品的OD_(490)值大于或等于阈值判为阳性,小于阈值判为阴性。该法有良好的敏感性、特异性和重复性,有临床实用价值。 在毕赤酵母GS115中表达的可溶性目的蛋白作为包被抗原,也建立了间接ELISA方法。该方法敏感性和重复性较好,但特异性和符合性较差,其根本原因是目的蛋白纯度较低,必须有行之有效的纯化方法,该蛋白才有应用价值。 本试验对ELISA试剂盒的开发作了初步研究。确定了试剂盒的组成成分,其保存条件、保存期、特异性、敏感性、符合性以及批内和批间的稳定性都有了可靠的检验数据,有望开发成可上市的试剂盒。


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