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羊痘病毒P32基因的克隆、表达及多重PCR诊断方法的建立

韩若婵  
【摘要】: 羊痘(Capripox)是由羊痘病毒(Capripoxvirus)引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病,在我国被列为一类动物疫病。羊痘病毒属痘病毒科(poxviridae)、脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae)、羊痘病毒属(capripoxvirus)的成员。羊痘病毒P32蛋白是位于羊痘病毒膜表面的主要结构蛋白,含有中和抗原表位,是目前世界各地分离、鉴定的所有羊痘病毒毒株所共有的且特异性很强的羊痘病毒结构蛋白。 针对羊痘病毒反向末端重复序列结构中的一段基因和P32蛋白基因分别设计一对引物,进行PCR扩增,扩增产物分别为289bp、969bp。通过对实验条件的优化,建立了诊断羊痘病毒的多重PCR(Multi-PCR)方法。经试验证实该法具有良好的特异性和敏感性,可用于对羊痘病毒进行快速诊断。 本研究应用PCR技术扩增了羊痘病毒P32蛋白基因,连接于pMD18-T载体,再将目的基因插入到表达载体pGEX-4T-1中,经PCR、酶切及测序鉴定,成功构建了重组表达质粒pGEX-P32。经IPTG诱导,目的基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达,目的蛋白的分子量为58ku,能够与羊痘血清反应。利用电洗脱方法对表达蛋白进行纯化,ELISA方法检测纯化重组表达蛋白的活性,证明纯化后的表达蛋白依然保持了与羊痘标准阳性血清的良好反应原性。


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