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固氮斯氏假单胞菌A1501铵转运基因amtB的结构分析和功能研究

侯胜强  
【摘要】: 固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501是一株分离白水稻根际的联合固氮细菌,属变形细菌γ亚族。铵转运基因(ammonium transporter gene)是生物体细胞内外氮素平衡重要基因,而铵又处于整个同化代谢的中央位置,因此详尽研究该基因对于固氮作用以及调节机制研究有重要意义。通过对其全基因组序列分析、设计两对引物,经PCR从野生型A1501中扩增出2684bp的片段,经过序列比对和Blast序列比较后确定包含amt完整基因,并且确定该菌含有两个紧密连锁的铵载体基因为amtB1和amtB2,分别包含12和11个跨膜结构域。并且在两个基因之间无启动子和终止子序列,利用RT-PCR方法证实了这一结果。 本研究从野生型A1501提取细菌总DNA,并分别克隆amtB1、amtB2部分片段,连接到自杀质粒载体pK18mob或pT18mob上,通过三亲接合与野生菌A1501进行同源单交换,经过抗性筛选获得了amtB1极性突变株、非极性突变株以及amtB2非极性突变株,分别命名为TB12极性突变株,TB1突变株,TB2突变株。 在高铵条件下测定细胞生长曲线发现,所有突变株相对于野生菌生长表型没有什么差异,但是在低铵浓度下,TB12极性突变株相对于野生菌A1501在平板显示出生长缓慢,而两个非极性突变TB1、TB2与野生菌A1501相似。测定铵吸收实验中发现,突变株TB1、TB2和野生菌胞外铵浓度下降趋势相似,而TB12极性突变株胞外铵浓度基本保持不变,证明两个铵载体基因突变的确影响细胞的转运能力。接下来生理实验测定结果显示:在菌株生长到稳定期后,TB12具有一定泌铵能力。当amt任何基因的突变后,并未影响到固氮酶活性,但是在固氮条件下,铵激后极性突变株的表型特征与其它菌株不一致,仍能保持比较高的固氮酶活生,而非极性突变和野生菌基本丧失固氮酶活性。 将极性突变株TB12和野生型A1501接种水稻,研究水稻光合作用和固氮作用之间的互作。结果表明:施用固氮菌后,对水稻有明显的促生作用,但突变株在根表竞争能力明显强于野生型,所占菌数总量的74%。并且接种后的水稻,无论在株高以及根系发达的程度均强于野生菌株,表现出明显促生作用。 通过利用amtB1完整基因互补TB12极性突变株,利用抗性筛选获得组成性表达质粒,命名为pLAB1。测定生长曲线,泌铵能力以及固氮酶活后发现,表型特征与野生型A1501相似,说明铵转运基因突变的确是影响细菌铵的转运能力,影响到了细胞内外氮素平衡。


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