蓖麻蚕体液胰凝乳蛋白酶抑制剂调查及其基因克隆

【摘要】： 蛋白酶抑制剂在自然界中无处不在，它们以多种形式存在于动物、植物甚至微生物的各种组织中，主要的生理功能是防止不必要的蛋白水解。胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一种，对维持昆虫正常的生长发育起着重要的作用。同时也是昆虫体内非细胞免疫系统的重要组成部分。蓖麻蚕是我国三大产丝昆虫之一，对其体内胰凝乳蛋白酶抑制剂的研究不但有助于蓖麻蚕本身生理、生化的研究，也必将对其他野生鳞翅目昆虫生理、生化的研究产生重要意义。 本研究通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和活性染色技术，对20个蓖麻蚕品种血液CI的种类和同一品种不同发育时期CI活性变化进行了调查。由于各种CI等电点不同，引起迁移速度有快慢，在碱性电泳中检测到7种CI，定名为E-CI1、E-CI2、E-CI3、E-CI4、E-CI5、E-CI6、E-CI7，等电点依次减小：在酸性电泳中检测到2种CI，定名为E-CIa、E-CIb。其中E-CI1、E-CI2、E-CI3、E-CI6、E-CI7、E-CIa、E-CIb为供试品种所共有，表明它们是蓖麻蚕生长发育所必需的。对同一蓖麻蚕品系不同发育时期血液CI的调查显示，随5龄期发育，CI的活性有逐渐递增的趋势。 根据家蚕中编码成熟CI-b1的cDNA序列设计引物，利用RT-PCR技术，对8个蓖麻蚕品种的CI基因进行了克隆。结果在8个品种中克隆的基因相同，基因序列长为189bp，预测编码62个氨基酸残基的成熟蛋白，对蛋白结构预测表明该蛋白有一个典型的Kunitz结构域。核苷酸序列同源性比较显示，克隆的序列包含了编码家蚕成熟CI-b1的完整核酸序列。 将蓖麻蚕E-CI基因克隆到表达载体pET28a中，转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，并用IPTG诱导重组蛋白表达，超声裂解后经SDS-PAGE检测，诱导的重组蛋白主要以包涵体的形式存在，融合蛋白的分子量大约为15kD，最佳诱导时间为8小时。