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大豆转化体系的构建及转化植株的功能分析

李宏宇  
【摘要】: 大豆的遗传转化是大豆基因功能分析的关键一步。近年来国内外已有不少实验室对大豆转化作了研究。本文目的在于对使用相同大豆品种不同转化方法进行系统比较。首先,对大豆遗传转化方法中的花器官注射法、超声波处理法、子叶节转化法、半种转化法和生长点转化法进行比较研究,在子叶节转化法中,我们对大豆不同品种再生率做了比较,找到再生率较好的品种垦农18;另外我们对其中的生长点转化法进行大规模实验,结果表明,生长点转化法可获得单批最好转化率0.31%,所有批次总体转化率为0.1%,子叶节转化法的单批最好转化率为0.31%,总的转化率为0.0008%,半种法单批最好转化率为0.2%,总的转化率为0.0026%,其它两种方法未获得转化植株,生长点转化法具有易操作、低污染、插入的拷贝数低等优点,重要的是不需进行组织培养,减少了体细胞突变对转基因植株表型的干扰,最重要的该方法不受品种再生难易的限制。因此,认为该方法是一较优的大豆非组织转化法。 与此同时,我们也对转基因植株筛选方法进行系统性比较,以大豆垦农18为研究材料,采用浸种法、根吸法、叶片涂抹法和喷洒法,筛选抗glufosinate再生植株,结果表明不同方法间筛选结果差距明显,浸种法对种子出苗率有影响,操作复杂;根吸法受土壤条件影响较大,土壤中有机质含量和土壤含水量均影响实验结果,重复性较差;叶片涂抹法受叶龄影响大,费工费时;而叶片喷洒法筛选结果可靠,重复性好,操作简单,省工省时。叶片喷洒法适宜的浓度为1:200稀释glufosinate(113.3mg/ml);该筛选法是四种筛选方法中最优的一种。 对获得的大豆开花相关基因的抗glufosinate大豆植株进行分子检测,PCR、Southern blot、RT-PCR和GFP定位,表明所获得的10株抗性植株均为转化植株,且后代的抗与不抗glufosinate的分离比基本符合孟德尔遗传规律。对开花时间测定表明,大豆开花基因CO、RGA1和MAF RNAi,在长日照条件下(16/8)与野生型垦农18相比晚开花;GAL2基因在大豆中过表达后,在长日下为晚花表型。拟南芥基因Cry1-N563转化大豆后开花时间与野生型无明显差异,但植株粗壮,稍矮化。


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