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哺乳动物朊蛋白与叠朊的原核表达及牛朊蛋白单抗制备

张杰  
【摘要】: 本文以基因克隆、表达和淋巴细胞杂交瘤技术为基础,制备并鉴定了针对秦川黄牛成熟朊蛋白mPrP的单抗,以期用于疯牛病的免疫诊断研究。 在秦川黄牛、甘肃土种绵羊和汉族人朊蛋白PrP和叠朊Dpl编码基因ORF的基础上,进一步构建出含成熟蛋白编码基因的重组表达质粒,经IPTG诱导实现了3个mPrP和3个mDpl的E.coli中的高效表达。以SAF-70单抗为检测抗体的Western Blot分析表明3个重组mPrP不仅具有强的反应原性而且能够在细胞内形成二聚体。蛋白酶K消化结果表明重组mPrP不具有朊病毒PrP~(Sc)的蛋白酶K抗性。 以纯化复性的黄牛mPrP免疫Balb/C鼠,加强免疫3天后取脾细胞与SP2/0细胞融合,间接ELISA法筛选阳性细胞株,并进一步鉴定亲和层析法纯化的腹水抗体。结果表明获得了7个能稳定分泌抗黄牛mPrP的细胞株,除N17抗体属于IgG2b外,其余均属于IgG2a。7个单抗腹水效价介于1×10~4-1×10~6之间,亲和常数介于10~9-10~(12)之间,与黄牛mPrP发生特异性反应,与绵羊和人的mPrP发生交叉反应,不与mDpl反应。表位分析显示单抗N15,N25,N59,N63和N67识别相同的抗原表位,单抗N17和N64识别mPrP羧基端的不同表位。Western Blot分析表明腹水单抗N64和N17可与健康黄牛脑组织PrP~C反应。实验获得的单抗N64和N17有望作为疯牛病的核心诊断试剂,为开发相关诊断试剂盒奠定了基础。


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