晋A棉花线粒体基因组BAC文库的构建及重要功能基因的筛选

【摘要】： 本研究以棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系为研究材料，构建了相应的线粒体基因组细菌人工染色体(BAC)文库，并以线粒体功能基因为探针得到阳性克隆。线粒体基因组文库的构建将为克隆相关基因和研究线粒体基因组结构提供重要的技术平台。其目的是克隆棉花线粒体基因组相关基因，了解棉花线粒体基因组的结构，进而克隆与不育性相关的基因。 研究获得以下结果： 1．本实验在借鉴了各类作物BAC文库的构建方法后，建立了一套高效的线粒体基因组BAC文库构建的技术体系，包括线粒体的分离、高质量大片段DNA的获得、大量部分酶切最佳条件的确定、片段大小的选择、高效的连接与转化体系等。 2．分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。 (1)不育系BAC文库的平均插入片段为22.29kb，空载率为0.9％；保持系BAC文库的平均插入片段为21.36kb，空载率为0.8％。据棉花线粒体基因组大小约为700kb计算，两个文库覆盖率分别为线粒体基因组的79和76倍，从理论上筛选出任何一个线粒体基因或序列的概率几乎为100％。 (2)插入片段可以在宿主大肠杆菌中稳定繁殖至少100代，无缺失、重组等现象发生，说明BAC克隆的插入片段可以在宿主大肠杆菌中稳定保存。 3．根据其它植物线粒体的功能基因设计引物，通过PCR扩增到相应的线粒体功能基因的片段orfB、coxI、atpA、nad4L和atp6，将这些片段分别克隆到pGM-T载体上，进行序列测定和对比确认。 4．通过不育系与保持系的orfB，coxI和nad4L3个基因的全序列的比较，证明晋A不育系与保持系在orfB、coxI和nad4L基因全序列上无差异。 5．利用棉花的线粒体功能基因或片断：orfB、coxI、atpA、nad4L和atp6对所构建的BAC文库进行菌落原位杂交，均筛选到了阳性克隆。 6．对棉花线粒体基因组的几个亚克隆进行序列测定表明：棉花线粒体基因组同样含有重复序列和来源于细胞核基因组叶绿体基因组序列。