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柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag13和sag14的克隆与原核表达研究

陈静  
【摘要】: 由艾美耳属球虫引发的鸡球虫病是严重危害养禽业的一种寄生虫病,长期以来的化学药物防治使球虫不断产生了抗药性,同时引发了动物源性食品的药物残留问题。采用强毒活苗和致弱疫苗接种预防鸡球虫病不失为一种手段。但由于活苗安全性较差、有效储存期短、不利于大规模生产等问题,促使人们开始研制新型疫苗——基因工程苗和/或核酸疫苗。因其可诱导产生较强的免疫保护反应等优点而倍受青睐。目前的研究焦点多集中在球虫入侵相关蛋白上,主要包括表面抗原以及各类微线体、棒状体、折射体等分泌型亚细胞器抗原,其中柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)表面锚定(GPI)抗原SAG13、SAG14在子孢子和裂殖子阶段均有表达。但有关表面抗原的生物学性质仍不很清楚。本试验克隆出抗原基因sag13、sag14并在原核中得以表达,为今后基因工程疫苗的研究提供了一定的基础。 (1)基因sag13、sag14序列的克隆与序列分析根据GenBank已报道的E.tenella表面抗原sag13、sag14基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法克隆了不含N端疏水信号肽序列的柔嫩艾美耳球虫sag13、sag14基因的编码序列。构建重组质粒pGEM-sag13、pMD19-sag14,分别转入感受态细胞Top10后测序鉴定。经DNAman软件分析测序结果,sag13全编码序列为732bp与GenBank中核苷酸序列同源率为100%;sag14全编码序列为738bp与GenBank中核苷酸序列同源率为100%,并应用SOPMA分析软件对SAG13、SAG14的一、二级结构分别进行了预测。 (2)原核表达载体pET30-sag13、pET30-sag14的构建与表达将克隆的球虫抗原基因sag13、sag14分别连入表达载体pET-30a(+)上构建重组子,将重组子pET30-sag13、pET30-sag14转入E.coli感受态细胞BL21-Gold(DE3)中,经Bandscan软件分析SDS-PAGE图得出两个外源蛋白分子量大小约为33.5kD、36kD,其分子量接近理论值(31.2kD、31.4kD),利用镍柱层析获得的高纯度蛋白进行Western blot鉴定,证实了外源蛋白在宿主菌中得到表达。通过改变培养条件,提高可溶性重组蛋白表达水平,在30℃条件下培养,0.4mmol/L IPTG诱导2h后收获菌体,此时融合蛋白SAG13的可溶性蛋白表达效率最高为56.5%;当30℃条件下培养,1mmol/L IPTG诱导4h后收获菌体,此时融合蛋白SAG14的可溶性蛋白表达效率最高为66.7%。在一定程度上有效的提高了可溶性外源蛋白表达量。


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