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病原诱导的小麦ERF、MYB转录因子基因TaPIEP1和TaPIMP1的分离、特性及功能分析

董娜  
【摘要】: 近年来,小麦纹枯病、赤霉病等病害对我国小麦生产的危害日益严重。小麦纹枯病、赤霉病抗性遗传基础研究薄弱,常规育种徘徊不前,其抗病反应机制亟待研究。本文以在植物防卫反应中起重要调控作用的ERF、MYB转录因子为研究切入点,采用2步法策略(首先鉴定受病原诱导的早期反应基因,然后分析其功能),对病原诱导的2个新的小麦ERF、MYB转录因子编码基因进行了全长序列分离和较系统的研究,旨在为揭示小麦抗纹枯病、赤霉病反应机制,开辟小麦抗纹枯病、赤霉病育种新途径奠定理论和材料基础。 本论文取得以下结果: 1.分离到2个病原诱导的小麦ERF、MYB转录因子编码基因TaPIEP1和TaPIMP1的全长序列。(1)采用同源克隆策略及RT-PCR和RACE技术,从小麦赤霉菌诱导的抗病小麦品系苏麦3号中,分离到1个小麦ERF转录因子编码基因TaPIEP1全长cDNA序列。源于苏麦3号和中国春的TaPIEP1基因组DNA序列和cDNA序列分析表明,该基因无内含子,编码由280个氨基酸残基组成的ERF转录因子TaPIEP1。TaPIEP1具有AP2/ERF DNA结合域、酸性转录激活域和核定位位点等ERF转录因子典型结构特征。TaPIEP1与其它ERF蛋白的全长序列一致性较低,与OsERF1的一致性最高,仅达36.46%,是植物ERF转录因子家族的一个新成员,属于该转录因子家族的B-3c亚群或IX亚群。(2)采用同源克隆策略及RT-PCR和RACE技术,从小麦赤霉菌诱导的抗病小麦品种苏麦3号中,分离到1个MYB转录因子编码基因TaPIMP1全长序列,编码由323个氨基酸残基组成的小麦MYB转录因子TaPIMP1。序列分析表明,TaPIMP1基因中具有一个内含子,长度为260bp,位于该基因编码区的第233个核苷酸(G)与第234个核苷酸(C)之间。序列比对分析表明,TaPIMP1是一个R2R3 MYB转录因子,与其它MYB蛋白的全长序列一致性较低,即使与一致性最高的OsJAMYB,仅为43.69%,是植物MYB转录因子家族的一个新成员。进化树分析表明:TaPIMP1与水稻OsJAMYB和拟南芥AtMYB108的关系比较密切,序列一致性分别为43.69%和40.11%,而与小麦中的其它MYB蛋白关系较远,序列一致性仅17.32%~28.48%。 2.明确了TaPIEP1基因的表达特性。Q-RT-PCR实验结果表明,TaPIEP1在小麦中的转录表达受小麦纹枯病菌、赤霉病菌和白粉病菌诱导,其中,在抗病小麦品种中的诱导表达比在感病小麦品种中的迅速、强烈,而且对小麦纹枯病菌和赤霉病菌的响应比对白粉病菌的响应明显迅速。推测TaPIEP1可能主要参与对小麦纹枯病菌和赤霉病菌的防卫反应。TaPIEP1在小麦中的诱导表达也受到防卫相关植物激素乙烯(ET)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导,其中,对ET和MeJA的响应比对SA的响应迅速,而且证明ET处理可以加速和增强TaPIEP1对赤霉病菌侵染的响应。推测TaPIEP1可能主要通过ET/JA途径参与对纹枯病菌和赤霉病菌的早期防卫反应,也通过SA途径参与对白粉病菌的防卫反应。 3.初步明确了TaPIMP1基因的表达特性。半定量RT-PCR实验结果表明,TaPIMP1基因在小麦中能够被小麦纹枯病菌、赤霉病菌,以及ET和MeJA诱导,初步推测TaPIMP1通过ET/JA的信号传导途径参与小麦对纹枯病和赤霉病的防御反应。 4.通过分子、生化分析证明TaPIEP1是能定位在细胞核、与GCC box结合的、激活型的小麦ERF转录因子。亚细胞定位结果表明,TaPIEP1-GFP融合蛋白集中分布在细胞核中,而对照GFP在细胞核和细胞质中均有分布,证明了TaPIEP1具有核定位的特性;凝胶阻滞结果表明,TaPIEP1不与DRE box顺式元件结合,仅与GCC box顺式元件特异性结合,且GCCGCC序列是GCC box的核心序列;酵母单杂交结果证明,TaPIEP1能够在酵母体内与GCC box结合,激活报告基因LacZ的表达。预测的转录激活域缺失后,TaPIEP1的转录激活活性降低大半,表明该预测的转录激活域确实是一个重要的转录激活域,但TaPIEP1中可能还存在另外一个转录激活区。 5.初步明确了TaPIEP1和TaPIMP1基因的一些抗病功能。通过基因枪法将TaPIEP1转入推广小麦品种扬麦12号中,对转基因小麦T0、T1代植株进行PCR检测和小麦纹枯病抗性鉴定。结果表明,与未转基因小麦受体(扬麦12号,病情指数为3~4级)相比,转TaPIEP1基因阳性的小麦植株对纹枯病的抗性显著提高(病情指数为0级),说明转TaPIEP1基因能增强小麦对纹枯病的抗性,该基因在小麦抗纹枯病反应中起正向调控作用。通过农杆菌介导法将TaPIMP1转入烟草中,对转基因烟草T0代植株进行PCR检测和烟草青枯病抗性鉴定。结果表明,一些转TaPIMP1基因阳性烟草植株提高了对青枯病的抗性,说明TaPIMP1以正向调控方式参与植物防卫反应。


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