收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

日本血吸虫不同发育阶段虫体差异表达基因解析

王欣之  
【摘要】: 血吸虫病人兽共患,分布广泛,危害严重。上世纪90年代,巴西、中国的的科学家分别在曼氏血吸虫和日本血吸虫的基因组测序及注释方面取得重要进展,获得大量有关血吸虫基因组一般生物学意义的大量信息。本研究则针对血吸虫生活史复杂,其生长发育过程中虫体呈现显著的生理学和形态学变化的特点,以在我国流行的日本血吸虫为对象,利用大规模、高通量的基因分离分析技术,开展了不同发育阶段虫体差异表达基因分离、鉴定和解析研究,为从分子水平阐明血吸虫生长发育及其与宿主相互作用的机制建立重要基础,为疫苗和药物研究开拓新途径。主要研究结果概述如下: 一、日本血吸虫7d童虫消减cDNA文库的构建及测序分析 利用抑制性消减杂交(SSH)技术,以日本血吸虫7天童虫为实验组,42天成虫为驱动组,首次构建了日本血吸虫早期童虫期别差异表达消减cDNA文库。获得的文库重组率为90%,大部分cDNA插入片段在500bp左右。从文库中选取6000个克隆测序,得到5474个ESTs信息,EST大小大多在300-900bp之间,平均长度为571bp。使用在线的PHRED工具对EST进行拼接,得到1764条clusters,包含456个contigs和1306个singletons。所得的Clusters数量约占日本血吸虫基因组的11~8.8%(预计血吸虫表达基因为15000~20000个)。利用半定量PCR验证在童虫消减文库所获呈高表达的四跨膜蛋白(Tetraspanin)、细胞色素氧化酶C (cytochrome C oxidase)、还原型辅酶脱氢酶(NADH dehydrogenase)、热休克蛋白90(HSP90)、可溶性血管内皮细胞生长因子受体(Soluble vascular endothelial cell growth factor receptor)和IBI protein基因在7天童虫和42天成虫中的表达情况,结果显示,这些基因在童虫中的表达量均高于成虫。在日本血吸虫基因组数据库报道的数量有限的童虫期别差异表达基因(156条clusters)也与我们的clusters一致。这都说明本研究构建的童虫消减cDNA文库具有较高的质量。 将所得的1764条Clusters与日本血吸虫基因组数据库(http:// function. chgc. sh. cn/ sj-proteome/ index. htm)进行比对,结果显示,65%(1146条)的clusters与已知日本血吸虫基因组序列一致或相似,35% (617条)clusters在日本血吸虫数据库中未见报道,约占日本血吸虫基因组的4.1%到3%。将617条日本血吸虫数据库无匹配的clusters与曼氏血吸虫数据库(http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_mansoni/)进行比对,结果显示仅有92条clusters与曼氏血吸虫同源,525条clusters在曼氏血吸虫中也未见报道。把与已知血吸虫数据库均无同源的clusters与NCBI的Nr数据库(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ blast/ Blast. cgi)比对,有211条clusters和数据库无任何同源性,提示他们可能是血吸虫特有的新基因。 利用生物信息学技术对1764个clusters的初步分析表明虽然只有约7.5%的cluster可查询获知其功能,但显示这些clusters都具有重要生物学意义。对所有功能明确的基因进行go分类,结果显示,所占比例最大的三类分别为:代谢进程(Metabolic process)相关分子,占31%;调节生物进程(Regulation of biological process )相关分子,占12%,胚胎发育(Embryonic development)相关分子,占11%。通过与秀丽杆线虫同源性比对进行KEGG信号通路分析,表明有175条clusters参与到糖酵解(Glycolysis)、氨基酸代谢(Amino acid metabolism)、花生四烯酸代谢(Arachidonicacid metabolism)、嘌呤代谢(Purine metabolism)等代谢途径和细胞通讯(Cell Communication)、泛素生物合成(Ubiquinone biosynthesis)、尿素循环(Urea cycle)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway)、碳固定(Carbon fixation)、蛋白酶体(Proteasome)、泛素调节的蛋白质降解(Ubiquitin mediated proteolysis)等25条信号通路中。值得一提的是,参与抗寄生虫药物丙体六氯苯降解途径(gamma-Hexachlorocyclohexane degradation)中的重要基因之一dehydrogenase与文库中chgc_new_contig406基因同源;对维持日本血吸虫在宿主血管内的生存极为重要的血管内皮细胞生长因子受体(soluble vascular endothelial cell growthor receptor)也在差异表达基因中出现。 二、日本血吸虫不同发育阶段差异表达基因研究 为分析日本血吸虫不同发育阶段差异表达基因状况,将5000个日本血吸虫cDNA克隆(4000个来自7d童虫消减cDNA文库的克隆和1000个来自尾蚴、雌雄虫、成虫和虫卵消减cDNA文库的克隆)定制cDNA芯片,每个克隆在芯片上重复点样3次。以7d虫体cDNA为对照,分别和日本血吸虫6个不同发育阶段(7d,13d,18d,23d,32d,42d)和42d雌虫、42d雄虫cDNA进行双通道杂交,每个阶段的样本做3次生物学重复。对每个基因杂交得到的9个杂交信号值(ratio值)用SAM软件进行分析,假阳性率(FDR)控制在5%以内,再以2倍标准筛选差异表达基因。7d虫体样本的自身杂交结果说明芯片平台可靠。再选择18个芯片杂交显示差异表达基因进行real time PCR验证,结果和芯片结果基本相符。 芯片杂交结果归纳如下: 1.发现了一批不同发育阶段差异表达的基因。芯片杂交结果显示,和7d虫体相比,13d虫体差异表达克隆有34个,代表22个基因,其中上调基因4个,下调基因18个,未知基因2个;18d虫体差异表达克隆有238个,代表123个基因,其中上调基因86个,下调基因37个,未知基因9个;23d虫体差异表达克隆有244个,代表136个基因,其中上调基因47个,下调基因89个,未知基因7个;32d虫体差异表达克隆有186个,代表99个基因,其中上调基因46个,下调基因53个,未知基因7个;42d虫体差异表达克隆有158个,代表95个基因,其中上调基因54个,下调基因41个,未知基因4个;42 d雌虫差异表达克隆有671个,代表基因262个,其中上调基因54个,下调基因208个基因,31个未知基因;42d雄虫差异表达克隆有171个,代表115个基因,其中上调基因94个,下调基因21个,未知基因8个。 2.聚类分析表明差异基因主要归为9类变化趋势。这9类基因的变化进行深入分析可能可发现一些与虫体发育过程中生物学变化特点相关的信息或线索。go的功能分析显示,合抱前虫体(13天,18天)的差异表达基因参与转录调节活性(transcription regulator activity),代谢(metabolism),结合(binding),蛋白水解(proteolysis)相关;而合抱之后的虫体(23天以后)差异表达基因,除了与代谢(metabolism),转录调节活性(transcription regulator activity),生物合成(biosynthesis)等基本的生物学功能之外,出现较多的是与有性生殖(sexual reproduction),配子发育(gametogenesis),生殖(reproduction),产卵(oviposition)等相关的基因。这些特点的出现正和日本血吸虫发育特征相符合。23天之后的虫体处于雌雄虫合抱、性成熟,生殖产卵阶段。 3.尽管目前大部分血吸虫基因都没有明确注释,对在本研究所发现的一些已知功能的差异表达基因进行功能分析发现他们在血吸虫生长发育过程中具有重要功能。一些已经得到公认的疫苗候选分子如谷胱苷肽S转移酶(glutathione S-transferase),Sj23(23 kDa integral membrane protein ),Ca2+结合蛋白(calcium binding protein),四跨膜蛋白( tetraspanin TE736),sm20,参与重要信号通路的RAS相关蛋白,参与PKC信号通路的蛋白,一氧化氮合成酶蛋白抑制剂(neuronal nitric oxidse synthase protein inhibitor),丝苏氨酸蛋白酶抑制剂等在本研究中也被证实在不同发育阶段呈差异表达。这也提示,血吸虫差异表达基因包括一些功能不明确的差异表达基因,都具有深入研究的价值。 三、日本血吸虫新基因sj-fibrillin和sj-COG8全长cDNA的克隆与分析 选择两个来自7d童虫消减cDNA文库中与数据库中已知基因无同源的日本血吸虫EST:SSH52.D11和SSH33.A7进行克隆和生物信息学分析。 根据SSH52.D11的EST序列,利用RACE技术扩增得到全长2251bp的cDNA序列,含有完整ORF,大小为2058bp,编码685个氨基酸,理论分子量为79519.9,等电点为5.22。用Interpro程序(http://www.ebi.ac.uk/Interproscan)对SWISS-PROT数据库进行检索,发现该蛋白含有多个表皮生长因子功能域(EGF like domain)和表皮生长因子样钙结合位点(EGF-like calcium-binding site),与Fibrillin蛋白家族的特点相符合(Timpl et al.,2003),推测其属于结构蛋白Fibrillin家族,命名为sj-fibrillin。经查询表明,该基因为日本血吸虫新基因,Genbank登录号分别为1067183(08年6月公开)。分别提取7d,13d,23d,42d的虫体总RNA,选择tublin作为内参,利用荧光定量PCR法对该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况进行实验验证,结果表明该基因在7d童虫的表达量最高。选取人homo(Genebank登录号1335064),小鼠mus musculus(Genebank登录号118136302),光滑爪蟾Xenopus laevis(Genebank Accession number 83628282)等12个物种的fibrillin蛋白进行进化树分析,结果显示日本血吸虫的fibrillin蛋白在进化上与小鼠最接近。对该基因编码蛋白的三级结构预测表明和人的fibrillin蛋白结构相似。该基因编码的蛋白作为细胞骨架蛋白Fibrillin基因在童虫时期高表达,可能与童虫快速生长,旺盛的细胞分化有关。 根据SSH33.A7的EST序列,利用RACE技术扩增得到全长2505bp的序列,含有完整的ORF,大小为2160bp,编码719个氨基酸,理论分子量为85160.4,等电点为5.03。经查询,该基因为日本血吸虫新基因,Genbank登录号为EU131676.1。分别提取7d,42d的虫体总RNA,选择tublin作为内参,利用荧光定量PCR法检测表明,该基因在童虫中的表达量高于在成虫中的表达量。利用NCBI的CDD程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)对该蛋白的保守结构域进行搜索,结果显示该蛋白含有高尔基体寡居蛋白组分8(COG8)的保守结构域Dor1。选取人Homo sapiens (GeneBank登录号21166361),小鼠Mus musculus(GeneBank登录号66392581),斑马鱼Danio rerio(GeneBank登录号61806582)等8个物种的COG8蛋白,进行保守结构域的分析和比较。并使用最大简约法(MP)绘制进化树进行分析。结果显示,该基因编码的蛋白属于寡聚蛋白家族,并与寡聚蛋白组分8(COG8)相似,推测该基因编码日本血吸虫高尔基体寡聚蛋白组分8,命名为Sj-COG8。COG蛋白是果蝇精子发育中的重要蛋白,与动物性腺发育相关。该蛋白在日本血吸虫童虫时期高表达可能在虫体性别发育中发挥重要作用。 综上,本研究首次构建了日本血吸虫早期童虫期别差异表达cDNA消减文库,发现了一批早期童虫差异表达基因、不同生长发育阶段虫体差异表达基因及日本血吸虫新基因的信息;分析显示一批在日本血吸虫不同生长发育阶段差异表达的基因在血吸虫生长发育中具有重要功能。克隆鉴定了sj-fibrillin和sj-COG8两个童虫期高表达的日本血吸虫新基因。本文结果既丰富了日本血吸虫基因组学的研究,更为分离、鉴定血吸虫生长发育关键分子、为从分子水平阐明血吸虫生长发育机制及血吸虫与宿主相互作用的机制提供了重要基础,为抗血吸虫病疫苗和新治疗药物的研制开发开拓了新途径和新思路。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 胡景韶;;西昌地区猪日本血吸虫病的初步调查[J];中国兽医杂志;1965年02期
2 薛德浩;猪发生姜片吸虫童虫病的报告[J];中国兽医科技;1982年01期
3 舒新华,易新元;抗曼氏血吸虫童虫单克隆抗体的制备[J];湖南农业大学学报;1999年03期
4 林矫矫,叶萍,田锷,朱顺海,石跃军,林邦发;IgM单抗体内、外杀伤日本血吸虫的研究[J];畜牧兽医学报;1995年03期
5 李增池;;吡喹酮治疗奶牛日本血吸虫病的副反应观察[J];云南畜牧兽医;1992年03期
6 ;药物治疗水牛日本血吸虫病试验[J];上海农业科技;1975年09期
7 代卓建,颜洁邦,夏德维;四川山区家畜日本血吸虫病流行病学调查研究[J];中国兽医杂志;1993年01期
8 李和平,吴发兴,陈德坤;日本血吸虫病免疫诊断[J];中国动物检疫;2005年09期
9 陈存瑞,郭金森,卢鸿义,廉守仁,林孝乙,乌力吉,张效武,黄海青;“肝15号”驱杀反刍兽肝片形吸虫童虫的试验[J];福建农业科技;1986年03期
10 刘国海;龚先福;;应用薄膜干卵抗原片环卵沉淀试验诊断耕牛日本血吸虫病[J];湖北畜牧兽医;1988年02期
11 金鑫,苏敬良;人兽共患病的现状与防制(七)——日本血吸虫病[J];动物保健;2005年04期
12 ;国产“拜耳9015”对人工感染肝片吸虫绵羊的童虫疗效试验[J];中国兽医科技;1973年03期
13 林建银;日本血吸虫皮肤型童虫透射电镜观察[J];动物学报;1986年04期
14 胡贵华;李兴荣;杜宗文;曾国熙;;一例犊牛日本血吸虫——沙门氏菌综合症的诊治报告[J];中国畜禽种业;2010年01期
15 才学鹏;丙硫苯咪唑对人工感染贝氏莫尼茨绦虫童虫的绵羊药效试验[J];中国兽医科技;1985年01期
16 吴兆敏;秉艺芳;方军;匡兴伟;;硝酸纤维膜作为一种新型放免固相载体对日本血吸虫病检测的研究[J];中国预防兽医学报;1993年02期
17 叶裕香;郑松;何强;陈春晓;;家畜日本血吸虫病的血清学检测与防治[J];福建畜牧兽医;2007年04期
18 ;农业血防流行病学网络分析系统[J];中国动物传染病学报;2011年02期
19 范必勤;吡喹酮疗法治疗家畜日本血吸虫病[J];中国兽医科技;1982年02期
20 杜远海;周大明;;10%吡喹酮水悬液第三胃注射以不同剂量治疗水牛日本血吸虫病的试验报告[J];湖北畜牧兽医;1988年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 汪世平;李宏实;周松华;周火炬;何卓;刘芬;彭先楚;余俊龙;高冬梅;秦永华;;抗日本血吸虫病阻断传播型疫苗的研究[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
2 毛广琼;;动物日本血吸虫病的防治[A];四川省动物学会第八次会员代表大会暨第九次学术年会论文集[C];2004年
3 张兆松;;日本血吸虫病分子疫苗的研究[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
4 朱传刚;江艳;林矫矫;杨艺;石耀军;陆珂;李浩;李小红;徐玉梅;;吡喹酮透皮给药治疗家兔日本血吸虫病[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
5 张磊;汪勇沛;朱传刚;林矫矫;钟旗;冉多良;;吡喹酮注射剂早期治疗小鼠血吸虫病效果的初步研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
6 刘朔婕;戴五星;;日本血吸虫多价膜锚定表达疫苗pIRES-Sj97-sj14-Sj26的构建及其免疫原性的研究[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年
7 易新元;何立;蒋明森;曾宪芳;;日本血吸虫病伴随免疫新模型的建立及抗再感染免疫机理研究[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
8 郑敏;蔡卫民;刘荣华;;日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝星状细胞差异表达cDNA文库的构建[A];第十三次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2004年
9 罗兴建;周晓农;肖邦忠;;人群血吸虫病抗体水平检测方法研究进展[A];重庆市预防医学会2006年学术交流会论文集[C];2006年
10 何立;蒋明森;赵琴平;蔡国斌;杨孟祥;;血吸虫感染新模型兔血清对童虫的体外杀伤实验[A];中国动物学会全国第九次寄生虫学学术讨论会论文摘要集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王欣之;日本血吸虫不同发育阶段虫体差异表达基因解析[D];中国农业科学院;2008年
2 刘彦;日本血吸虫脱尾活童虫表膜结合肽的亲和筛选与功能鉴定[D];中南大学;2011年
3 刘碧源;日本血吸虫细胞选择培养与用SV40大T抗原基因转染的研究[D];中南大学;2012年
4 朱翔;日本血吸虫辐照尾蚴免疫小鼠早期免疫应答特征及其相关分子机制的研究[D];南京医科大学;2005年
5 孙军;东方田鼠天然抗日本血吸虫病机制的研究[D];中国农业科学院;2004年
6 梁越进;吡喹酮抑制日本血吸虫病小鼠肝脏纤维化和炎症应答的作用及机制[D];南京医科大学;2011年
7 许静;LAMP检测法用于日本血吸虫病早期诊断及疗效考核的研究[D];苏州大学;2011年
8 蔡鹏飞;日本血吸虫多表位疫苗构建探索和TSP-2抗原鉴定[D];中国协和医科大学;2008年
9 姜宁;日本血吸虫RNA疫苗探索及Sj23抗原对宿主免疫调节机制的研究[D];吉林大学;2009年
10 车宏莉;日本血吸虫病免疫传感技术检测方法的研究[D];中南大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杜海林;青蒿琥酯抗日本血吸虫作用的研究[D];苏州大学;2009年
2 曹仁祺;日本血吸虫病环介导等温扩增诊断方法的建立和初步应用[D];华中农业大学;2010年
3 李晔;抗日本血吸虫病二价多表位疫苗研究[D];扬州大学;2010年
4 祝慧萍;日本血吸虫病诊断试验评价的meta分析[D];华中科技大学;2009年
5 赵志荣;日本血吸虫Mago nashi基因的克隆、表达与功能鉴定[D];安徽医科大学;2007年
6 祝慧萍;日本血吸虫病诊断试验评价的meta分析[D];华中科技大学;2009年
7 王敏;rSj26-Sj32融合蛋白用于急性日本血吸虫病的诊断价值[D];重庆医科大学;2011年
8 张云霞;日本血吸虫文库筛选、Tetraspanin2的抗体检测及其单抗的制备[D];安徽医科大学;2009年
9 谭牛仔;吡喹酮微球与肝纤宁合用抗血吸虫实验研究[D];湖南中医药大学;2007年
10 魏琦;日本血吸虫肝期童虫表膜结合多肽的筛选与初步鉴定[D];中南大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 刘延年 刘锡斌;家畜日本血吸虫病的防治[N];山东科技报;2004年
2 胡玲 高璐璐 张海龙;青蒿琥酯可预防日本血吸虫病[N];健康报;2003年
3 岳阳;国内生物信息平台首发大规模基因组数据[N];中国医药报;2006年
4 记者  章迪思 实习生 周惠婷;血吸虫基因“天书”全球发布[N];解放日报;2006年
5 刘建迪 赵卫卫 陈茂樑;我国学者提出“晚血”肝纤维化防治新举措[N];中国医药报;2007年
6 本报记者  覃红 谭克扬 徐亚平 通讯员  蔡雄;李岳生:借得科技送“瘟神”[N];湖南日报;2006年
7 杨丽佳;血吸虫病诊断时间大大缩短[N];健康报;2006年
8 ;血吸虫病防治知识问答[N];湖南科技报;2004年
9 湖南省林科院副研究员 汤玉喜;血吸虫病与钉螺[N];湖南科技报;2007年
10 记者 胡宇芬;血吸虫病防治关键技术取得重大突破[N];湖南日报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978