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中国部分地区猪流感病毒的分子流行病学研究

于海  
【摘要】: 猪流感(Swine influenza, SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起的一种急性高度接触传染性的群发性猪呼吸道疾病,具有重要的兽医和人类公共卫生学意义。 为了有效地配合SIV流行病学调查,本研究首先根据SIV的M、HA、NA基因设计了6对引物,分别用于SIV的诊断及H1、H3、H9、N1和N2亚型SIV的快速鉴定。所建立的SIV型和亚型RT-PCR检测方法有很好的特异性,可以检测到102~103EID50的SIV,并在初步的临床样品检测中得到了应用。 为了了解我国SI的流行情况,2005年~2007年,我们先后在黑龙江、河南、山东、浙江、安徽、江西、北京、广东、广西9个省份的不同猪场,进行了600份样品的采集,分离到22株SIV,其中H1N1亚型1株、H3N2亚型4株、H9N2亚型4株。为了检测这9株SIV对哺乳动物的致病性以及在哺乳动物群体内的水平传播能力,我们进行了小鼠致病性试验,试验结果表明:这9株SIV对小鼠的致病力较弱,不引起明显的临床症状,不具备在小鼠之间水平传播的能力,但在感染后的第4天和第8天可以在小鼠的肺组织中分离到病毒。 古典H1N1亚型SIV和禽源H1N1亚型SIV广泛流行于世界范围内的猪群中。关于人源H1N1亚型SIV,世界范围内报道较少。2006年我们在广东省的一猪场分离到1株人源H1N1亚型SIV,并首次在中国进行相关报道。结合华中农业大学最近公布的2株人源H1N1亚型SIV的全基因序列,我们对这3株病毒进行了相关的遗传演化分析。3株SIV的8个基因片段核苷酸同源性分析结果表明,A/swine/Guangdong/96/06与2000年左右的人流感病毒有较高的同源性,8个基因片段核苷酸同源率在98.8~99.6%之间;A/swine/Tianjin/01/04和A/swine/Henan/01/06与1986年左右的人流感病毒有较高的同源性,8个基因片段核苷酸同源率在98.2~100%之间。3株SIV的遗传演化分析结果及HA、NA氨基酸分析结果也均表明,这3株SIV都属于人源谱系的SIV,基本保留了人流感病毒的特性,分别起源于2000年左右的人流感病毒和1986年左右的人流感病毒。这些流感病毒的存在,特别是古老的人流感病毒在猪体内的存在,对我国流感病毒的生态分布和遗传演化研究具有非常重要的意义。 猪具有同时感染禽流感病毒和人流感病毒的能力,被认为是新的流感病毒产生的中间宿主和基因混合器。本研究进行了1970~2006年44株H3N2亚型SIV的遗传演化分析,第一次全面总结和报道了完全人源的、二源重组的和三源重组的H3N2亚型SIV在我国猪群的相互存在。早在1970第一株完全人源的H3N2亚型SIV(Hong Kong/68-like)从台湾省的猪群中分离到,此后Victoria/75-like,Syndney/97-like,New York/99-like和Moscow/99-like的SIV陆续从我国的猪群中分离到;在1980年左右,2株三源重组的H3N2亚型SIV在我国出现,并已经被学者们报道;最近,二源重组的H3N2亚型SIV(HA和NA基因来自人流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因来自禽流感病毒)和三源重组的H3N2亚型SIV(HA和NA基因来自人流感病毒,NP基因来自古典的H1N1亚型SIV,PB2、PB1、PA、M和NS基因来自禽流感病毒)在我国猪群中被分离到。这些SIV的存在,特别是重组的SIV的存在,充分地证实了猪确实能作为流感病毒产生的“混合器”,具有重要的人类公共卫生意义,进一步强调了加强我国SIV监控的重要性。 H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽,而且也可以感染猪和人。2007年3月,正值猪呼吸与繁殖综合征(PRRS)发病期间,我们在广西省多个猪场共采集50份左右临床样品,同时进行了PRRSV和SIV的RT-PCR检测,其中有4份样品PRRSV和SIV的检测结果都为阳性,并分离出相应的4株PRRSV和SIV,相应的SIV代表毒株命名为A/swine/Guangxi/7/07(H9N2)。序列分析表明,A/swine/Guangxi/7/07的8个基因片段与A/Pigeon/Nanchang/2-0641/00和A/Wild Duck/Nanchang/2-0480/00有较高的同源性,可能起源于A/Duck/Hong Kong/Y280/97-like H9N2亚型禽流感病毒。为了进一步了解我国禽源H9N2亚型SIV的遗传演化规律,我们从GenBank中调取了另外24株H9N2亚型SIV进行了相关的研究。遗传演化分析表明,这25株禽源H9N2亚型SIV可以划分10个基因型,其中B型的5株病毒起源于A/Duck/Hong Kong/Y280/97,C型的5株病毒起源于A/chicken/Shanghai/F/98,其余的15株存在复杂的重组现象。本研究使我们对我国禽源H9N2亚型SIV的分子进化有了全新的理解,为我国动物流感疫情监测及预防控制提供理论依据。 为全面了解SI在我国的流行情况,我们在进行SIV分离鉴定的同时,也开展了SI的血清学调查。2005~2007年,我们先后在9个省份的不同猪场,进行了717份血清样品的采集。通过血凝抑制试验,我们进行人源H1、人源H3、禽源H5、禽源H9亚型SIV抗体的检测,阳性率分别为0~20.8%、29.6~97.1%、1.1~13.2%、6.5~31.6%,其中以人源H3亚型阳性率最高,说明人源H3亚型SIV可能在我国猪群中相当普遍;人源H1亚型SIV的抗体呈现较低的阳性率,表明人源H1亚型SIV可能零星感染中国的猪群;另外,我们也检测到了猪群中禽源H5和H9亚型流感病毒的抗体。H3亚型SIV是我国猪群流感病毒流行的主要亚型之一,为方便以后H3亚型SIV抗体的检测,我们表达了H3N2亚型SIV的HA1蛋白,建立了基于HA1蛋白的间接ELISA方法,并初步用于临床血清样品抗体的检测。 近几年,H5N1亚型禽流感病毒已跨越了“猪-禽”的种间屏障,在我国猪群中存在。为了进一步研究禽源H5N1亚型SIV的致病机制及病毒的结构与功能,本研究选取一株背景清晰的SIV分离株(A/swine/Fujian/NP/01)进行反向遗传平台的构建。目前,我们已经获得了序列准确的8质粒,下游的病毒拯救工作还在继续进行当中。


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