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鸡传染性支气管炎病毒核蛋白抗原表位鉴定与单链抗体初步研究

徐佳  
【摘要】: 鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus,IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。各种日龄的鸡均易感染。该病主要造成蛋鸡产蛋量和蛋品质下降,引起肉鸡的增重和饲料转化率下降,雏鸡可由于呼吸道或肾脏感染而造成死亡。此外,IBV往往引起其他病原微生物的混合感染,从而加重了对鸡群的危害,给全球养禽业带来巨大经济损失。IBV病毒含有4种结构蛋白:纤突蛋白(Spike,S)、小膜蛋白(Small envelope,E)、膜蛋白(Membrane,M)和核蛋白(Nucleocapsid,N)。其中N蛋白是磷酸化蛋白质,可与病毒RNA结合,构成螺旋状核衣壳。N蛋白又是诱导机体免疫应答,尤其是细胞免疫应答的重要免疫原蛋白。因而N基因及其编码蛋白是IBV研究的一个热点。本研究以鸡传染性支气管炎病毒核蛋白作为研究的靶蛋白。 利用鸡传染性支气管炎病毒中国分离株tl/CH/LDT3/03,经4次免疫BALB/c小鼠,无菌取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG1450进行化学融合。通过经典杂交瘤技术获得了4株杂交瘤细胞。以本研究表达的重组IBV N蛋白和全病毒作为抗原,采用间接ELISA和western blotting分析,证明4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)均能够特异地与tl/CH/LDT3/03全病毒和重组N蛋白反应,为抗传染性支气管炎病毒tl/CH/LDT3/03N蛋白的单克隆抗体,分别命名为6H3、5E12、2C4和6F9。其染色体数目分别为90、99、91和102条,单克隆抗体亚类鉴定结果为mAb 6H3、mAb 2C4属于IgG1、mAb 5E12属于IgM、mAb 6F9为IgG2b,轻链均为κ链。 在此基础上,本研究对2株单克隆抗体6H3和6F9的抗原表位进行初步鉴定。首先将N基因分成相互重叠的8个片段(N1、N2、N、N4、N5、N1-1、N1-2、N1-3)克隆至pGEX-6p-1载体GST标签下游,并转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,重组蛋白分别命名为GST-N1、GST-N2、GST-N3、GST-N4、GST-N5、GST-N1-1、GST-N1-2和GST-N1-3。经western blotting分析,mAb 6H3表位的初步定位在80-99aa。而mAb 6F9表位的初步定位在64-82aa。同时,选用不同致病型和组织嗜性的IBV中国分离株CK/CH/LDL/97Ⅰ、CK/CH/LHN/00Ⅰ、CK/CH/LSD/05Ⅰ、CK/CH/LSC/99Ⅰ、CK/CH/LHLJ/04Ⅴ、CK/CH/LHB/08Ⅰ和CK/CH/LAH/08Ⅱ以及4株不同致病性的其他毒株IBN、M41、H120和T作为抗原进行了western blotting分析,结果显示mAb 6H3可与除CK/CH/LHB/08Ⅰ以外的其他IBV发生反应。推测这11个IBV分离株氨基端第80-99aa区域内含有相同的一个B细胞表位。而mAb 6F9则不与CK/CH/LAH/08Ⅱ和CK/CH/LHB/08Ⅰ这两个分离株发生反应。 此外,本研究选择了mAb 6H3作为研究对象,构建了抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体(single chain variable fragment,scFv)。利用TRIzol法提取杂交瘤细胞株6H3的mRNA,采用RT-PCR法扩增出重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将重链和轻链通过linker连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。对表达产物应用ProBond~(TM)Purification System纯化系统进行蛋白纯化,将纯化后蛋白用6~0mol/L尿素梯度复性溶液对scFv变性蛋白进行复性。纯化复性后,用夹心ELISA和Western blotting测定scFv的活性,结果表明scFv不但可以与亲本病毒tl/CH/LDT3/03发生反应,而且可以与重组N蛋白发生特异性结合,这与它的亲本杂交瘤细胞株分泌的单抗的反应是一致的。该结果为IBV单链抗体作为治疗性生物制剂的研究提供了进一步研究的工具,同时对其他冠状病毒的相关研究具有借鉴意义。


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