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微生物蛋白激发子PeaT1的生物功能与结构解析

刘权  
【摘要】: 蛋白激发子是一类可诱导植物产生防卫反应的蛋白质。蛋白激发子具有无污染、不引起靶标生物产生抗药性的优点,符合农业可持续发展的需要,成为了现代植物保护的一条新途径。PeaT1是本实验室从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离得到的一种蛋白激发子。研究表明,该蛋白具有促进作物生长和提高作物品质的作用。本文对PeaT1进行了生物学功能、耐热性机制和三级结构的研究,并对PeaT1结构与功能的关系进行了初步探讨,为进一步研究PeaT1的作用机理提供了科学依据。主要结果如下: 1、PeaT1表达工程菌的构建。将peaT1基因连接至优化后的pET28a原核表达载体,得到简化的表达蛋白(仅带有6×His标签)。将pET28a-peaT1质粒转化E.coli BL21(DE3),获得了可进行高密度发酵的PeaT1工程菌。 2、PeaT1的表达与纯化。对PeaT1进行高密度发酵,得到了大量、高产率的粗蛋白。通过Ni-NTA Resin亲和纯化、Mono Q阴离子交换纯化和Superdex200分子筛纯化,最终获得了纯度90%的目的蛋白。建立了PeaT1制备和纯化的技术路线。 3、PeaT1的生物学功能。通过设计实验对高纯度的PeaT1蛋白进行了生物学功能检测。结果表明,PeaT1具有增强水稻抗旱性、提高水稻耐寒性和提高烟草对TMV病毒的抗性的作用。证明PeaT1是一种具有综合诱导效应的蛋白激发子。 4、PeaT1的结构研究。 1)用真空紫外圆二色谱检测了PeaT1蛋白二级结构与温度变化的关系。在温度由低-高-低的变化过程中,β折叠比例基本保持不变,而α螺旋比例随温度升高而减少,又随温度降低而恢复为原来水平。这说明在温度变化过程中,β折叠相对稳定和α螺旋随温度变化发生可恢复性变化,是维持PeaT1蛋白热稳定的结构机制。 2)用气相扩散悬滴法,通过优化结晶条件,在20% PEG 3350,0.2M MgCl2,0.1M Mes pH6.0的条件下得到了适合于X-衍射的蛋白晶体。使用Rigaku X-衍射仪进行衍射,得到了分辨率为2.4?的衍射数据。以1tr8A为模板,经过分子置换得到了PeaT1中NAC结构域的结构模型。在这个结构模型中,两个NAC结构域形成一个二聚体的核心结构,该核心结构中间为一个孔洞,周边由6条β折叠片互相交错形成。 3)用小角散射检测了PeaT1在小角区域的X射线散射信息,获得了PeaT1蛋白的空间结构轮廓。整合PeaT1已知的结构信息,构建了PeaT1蛋白完整的二聚体结构模型。这个模型的中心为NAC二聚体结构,第一部分(1-62位氨基酸)和第三部分(113-163位氨基酸)围绕这个中心异源聚合在一起,UBA结构域分布在两端。 5、PeaT1结构与功能的关系。按照结构域将PeaT1划分为四个片段,分别进行原核表达和纯化得到表达蛋白。四个片段诱导烟草抗TMV的效果都不明显。这说明PeaT1的生物功能需要其全长蛋白,一个具有完整二聚体结构的PeaT1可能是行使生物功能的基础。


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