甜高梁茎秆糖分积累关键酶基因克隆及功能标记开发

【摘要】： 茎秆含糖量是甜高粱品质评价的重要指标,对燃料乙醇的生产有着重要的影响,研究甜高粱茎秆糖分积累的机理对甜高粱品质改良具有重要的意义。本研究首先选用3个早熟、4个中熟和3个晚熟材料,测定其成熟期茎秆6个节间的果糖、葡萄糖、蔗糖和总糖含量以及中性转化酶(Neutralinvertase,NI)、可溶性酸性转化酶(Soluble acid invertase,SAI)、蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphatesynthase,SPS)和蔗糖合成酶(Sucrose synthase,SS)活性,并对茎秆不同节间的糖分分布情况和糖分与酶活的相关性进行了研究。随后,利用电子克隆结合PCR扩增的方法,克隆了在糖分代谢的中的关键酶SPS、SS和SAI基因,并进行了结构和功能分析。最后,利用SAI等位基因之间的序列差异开发了一个功能标记SBX1,并利用171份甜高粱材料对标记的有效性进行了验证。主要结果如下: 1.早、中、晚熟材料间果糖、葡萄糖、蔗糖和总糖含量差异明显。果糖变化范围为1.77-12.43mg/g,葡萄糖变化范围为1.44-14.63 mg/g,蔗糖变化范围为35.92-95.92 mg/g,总糖变化范围为42.65-100.54 mg/g。蔗糖是成熟期茎秆中的主要糖分,大约占总糖的84%,果糖和葡萄糖大约占16%。早熟和中、晚熟材料的糖分分布方式不同,随着节间的变化(1-11),早熟材料己糖(果糖+葡萄糖)含量呈现下降的趋势,蔗糖含量呈现上升的趋势,而中、晚熟品种己糖含量呈现“∪”型分布,蔗糖含量则呈现“∩”型分布。葡萄糖和果糖含量存在显著的正相关性(r=0.98,P＜0.01),己糖和蔗糖含量之间也存在显著负相关性(r=-0.54,P＜0.01)。 2.在成熟期茎秆中,不同节间的NI、SAI、SPS和SS酶活性普遍较低,都在35mg/g以下。随着节位的变化(1-11),NI、SAI、SPS和SS酶活性均呈现下降的趋势,但是SPS和SS在某些节间存在较大的波动。 3.以不同节间计算,己糖含量与四种酶活性都无任何相关性;蔗糖含量与SAI和SPS-SAI酶活性具有显著的负相关性(r=-0.54,P＜0.01,r=-0.61,P＜0.01);总糖含量与SAI和SPS-SAI酶活性也具有显著的负相关性(r=-0.52,P＜0.01);r=-0.57,P＜0.01)。以整株茎秆计算,己糖含量与SAI酶活性呈现显著的正相关性(r=0.73,P＜0.01);蔗糖含量与SAI和SPS-SAI酶活性具有显著的负相关性(r=-0.77,P＜0.01;r=-0.82,P＜0.01);总糖含量只与SAI存在负相关趋势,与SPS有正相关的趋势,没有达到显著水平,而与SPS-SAI酶活性具有显著的正相关性(r=0.75,P＜0.05)。 4.获得了甜高粱SPS基因DNA序列(Sps3-1,NCBI登录号为FJ750250)。此基因属于SPS基因D家族。Sps3-1长6325 bp,包含13个外显子和12个内含子。内含子序列均以GT开始,以AG结尾,其外显子-内含子结构与甘蔗SPSⅢ-2非常相似。SPS3-1 cDNA序列长为2910 bp,包含一个2895bp的开放读码框(ORF),编码的蛋白序列含有964个氨基酸,分子量大小为108.0kDa,等电点pI为6.15。此蛋白包含GT1蔗糖合成活性位点(158-650),能催化6-磷酸果糖和UDPG形成6-磷酸蔗糖,推测此蛋白具有合成蔗糖功能。SPS3-1编码的蛋白与甘蔗、水稻、小麦等作物具有较高的同源性(90-98%)。将Sps3-1序列与GRAMENE网站上的高粱基因组DNA进行Blastn检索,发现Sps3-1基因位于高粱第4染色体上,而且只发现一个拷贝数。 5.获得高粱SS基因DNA序列(Susy2,NCBI登陆号为FJ513325)。Susy2长为4587 bp,包含15个外显子和14个内含子。其14个内含子的剪接方式都为GT-AG模式。其外显子-内含子结构与甘蔗Susy2结构非常相似。Susy2 cDNA序列长为2646 bp,包含一个2409bp的ORF。Susy2编码的蛋白含有802个氨基酸,分子量大小为91.7 kDa,等电点pI为6.15。结构域分析表明,Susy2编码蛋白含有有一个475个氨基酸的糖基化酶家族GT1保守结构域(275～759),催化6-磷酸果糖和UDPG形成6-磷酸蔗糖。Susy2编码的蛋白与甘蔗、玉米、竹子、水稻、小麦、黑麦草等植物的SuSy同源性非常高(92-99%)。将Susy2序列与GRAMENE网站上的高粱基因组DNA进行Blastn检索,发现Susy2基因位于高粱第10染色体上,而且只发现一个拷贝数。 6.获得高粱SAI基因DNA序列(Sai-1,NCBI登录号为FJ768685)。Sai-1长为3409 bp,包括3个外显子和2个内含子。Sai-1序列与甘蔗ShinvA序列相似性很高,同源性为96%。Sai-1与水稻INV3基因结构相似。Sai-1 cDNA序列长为1683 bp,含有一个558个氨基酸的多肽,分子量大小为61.9kDa。此多肽含有一个完整的糖基水解酶(Glycosyl hydrolases family 32)结构域,推测其具有水解蔗糖的功能。Sai-1编码的蛋白与甘蔗、水稻、玉米等作物的SAI具有很高的同源性(84-96%)。将Sai-1序列与GRAMENE网站上的高粱基因组DNA进行Blastn检索,发现Sai-1基因位于高粱第4染色体上,而且只发现一个拷贝数。 7.克隆了甜高粱SAI基因的4个等位变异类型Sai-1a、Sai-1b、Sai-1c和Sai-1d DNA序列。4种等位变异包含35个SNP位点和13个In/Del位点,其中A/T类型有10个,A/G类型有10个,C/T类型有9个,C/G类型有6个。根据Sai-1a、Sai-1b、Sai-1c和Sai-1d第二内含子的一段插入缺失开发了一个功能标记SBX1,分别能扩增出132bp、136bp、141bp和122bp的条带。通过对171份甜高粱材料的检测,证实了132bp的条带与低含糖量有关,而136bp、141bp条带与高含糖量有关。