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拟南芥胚胎发育相关基因AtFEM和鼠李糖合成酶基因AtRHM1的功能分析

王金凤  
【摘要】: 本论文第一部分工作是关于一个影响胚胎发育的AtFEM基因的研究。植物中精确控制基因的表达对于胚胎和胚乳的发育是非常关键的。目前已经发现,超过250个基因的突变可以导致胚胎发育异常(或致死),这些基因的正常表达对于胚胎的正常发育是必需的,对胚胎发育的影响不尽相同。已知的引起胚胎发育缺陷的基因编码执行不同功能的蛋白,包括代谢、细胞生长、转录、蛋白命运、蛋白转运和受阻以及植物防御。在拟南芥中, F-box蛋白有700个以上,通过参与SCF复合体介导底物蛋白降解。遗传分析表明,F-box蛋白在许多信号传导途径中发挥作用。关于F-box蛋白参与胚胎和胚乳发育已经有一些报道。F-box蛋白TIR1和AFB在胚胎形成过程中调节生长素的反应,tir1-1 afb2-1 afb3-1突变体的胚胎在早期发育异常。F-box蛋白AtSFL61和AtSFL70参与胚胎或雌配子体的发育,AtSFL61突变引起胚胎败育,突变体胚胎细胞不正常分裂;atsfl70/+杂合突变体胚珠种子败育率为50%,由雌配子体致死所引起。本论文中对一个F-BOX EMBRYO LETHAL (FEM)基因进行研究,预测该基因编码的蛋白是一个参与细胞周期的F-box蛋白,Atfem的T-DNA插入突变可以引起隐性胚胎致死表型。自交的杂合体植株产生几乎25%的不正常种子,这些种子最终萎缩败育。突变体的胚胎大部分停滞在晚球形期,其中有的败育胚胎停滞在球形向心形过渡期。在1-细胞期和2-细胞期时,野生型和突变体胚胎没有明显区别;野生型胚胎发育到球形期时,突变体胚胎主要处于8-16细胞期;野生型胚胎发育到心形期时,突变体胚胎主要处于早球形期;野生型胚胎继续发育为成熟胚胎,突变体胚胎大部分仍处于晚球形期,没有胚胎可以发育到心形期,突变体胚胎最终败育。突变体的胚胎除了发育迟缓,另一个明显的特征是细胞分裂异常,分裂板的位置发生变化,最终产生了形态各异的不规则的球形期胚。此外,突变体的胚乳核数目与野生型相比显著降低。FEM蛋白包含两个LRR结构和两个F-box结构域。GUS染色结果显示,FEM在幼苗、莲座叶、种荚、花序均有表达。在幼苗的子叶和新生真叶表达强烈,特别是在叶脉上表达明显,根上只有少量表达。直到胚胎发育到成熟期,FEM在胚乳和胚胎中一直有表达,在胚乳中表达强烈,在胚胎中相对较弱。以上结果表明,FEM基因对于胚胎和胚乳的发育是非常重要的。 本论文第二部分工作是关于鼠李糖合成酶基因AtRHM1的功能分析。在植物进行正常的生命活动时,细胞壁是植物细胞不可缺少的重要部分。细胞壁不但在维持细胞形态与细胞之间黏结、决定细胞壁的强度和调控细胞伸长等方面起了必要的作用,而且还参与了细胞的分化、抗病、细胞识别与信号传导等一系列生理过程。细胞壁成分包含纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白等。L-鼠李糖是拟南芥细胞壁果胶多聚糖的重要组分之一,在模式植物拟南芥中由三种鼠李糖合成酶AtRHM1,AtRHM2和AtRHM3催化合成。拟南芥中的RHM2基因的等位基因是MUM4(MUCILAGE-MODIFIED4)。RHM2基因突变导致拟南芥种皮粘液中鼠李糖和半乳糖醛酸含量的减少,进一步证实了RHM蛋白具有鼠李糖合成酶的功能。已经发现,RHM1参与拟南芥根毛的形成,但是AtRHM1蛋白的体内酶学活性和亚细胞定位仍然不清楚。本论文对AtRHM1的功能进行了进一步的阐述。AtRHM1与拟南芥中RHM家族的其它成员有很高的相似性,与其它植物例如水稻和葡萄也有高的相似性。AtRHM1启动子-GUS (Prhm1)融合表达结果表明AtRHM1几乎在各个组织器官表达,尤其在幼苗的根、子叶和植株花序表达强烈,GUS染色结果与RT-PCR结果一致。这与AtRHM3基因的表达模式相似,但AtRHM2基因的表达模式不同,AtRHM2/MUM4在繁殖器官中表达量较高,如种子等。对AtRHM1不同缺失启动子(Pd1,Pd2,Pd3,Pd4,Pd5)GUS转基因植株GUS染色结果表明:Prhm1和Pd1在整体上的GUS表达模式一致,即在整株幼苗都有表达,只是在染色程度上Pd1比Prhm1稍弱;而对于Pd2与Pd1染色情况比较来看,Pd2的子叶染色弱而根上几乎无染色,而Pd1的根上有很深的染色,表明RHM1启动子中的-752 bp~-308 bp这段序列可能与根特异表达相关;Pd3幼苗子叶上的染色较Pd2明显降低,2天时子叶无染色,4、7天的子叶只有顶尖处有稍许表达,表明-308 bp~-140 bp序列可能与子叶特异表达相关,而在RHM1基因启动子-752 bp~-308 bp含有两个G-box和一个与伤害有关的调控元件,在-308 bp~-140 bp区域中存在ACTT和ABRE元件。AtRHM1的表达受糖和伤害诱导,RHM1基因启动子中与伤害诱导相关的顺式作用元件可能位于-308 bp~140 bp,与葡萄糖应答相关顺式作用元件可能位于该基因启动子-931 bp~-752 bp区域。已有假设指出许多核糖转化酶定位在细胞质。Reiter和Pai指出烟草中一种UDP-D-apiose/UDP-D-xylose合成酶NbAXS1通常定位在细胞质。共聚焦显微镜观察表明GFP::AtRHM1融合蛋白定位在子叶细胞的细胞质,这说明AtRHM1是一种细胞质定位的蛋白。AtRHM1代表了RHM家族中第一个定位在细胞质的鼠李糖合成蛋白,这与许多其它参与细胞壁生物合成的核糖转化酶定位在细胞质相符。拟南芥中AtRHM1基因过表达导致叶片细胞壁的鼠李糖含量增加了40%,同时,甘露糖和葡萄糖的含量也发生了改变。而RNAi株系细胞壁中主要单糖包括鼠李糖的含量没有任何明显的改变。傅里叶变换红外光谱分析表明AtRHM1过表达株系中增加的鼠李糖参与了鼠李糖苷的合成。


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