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无花果曲霉利用醋糟产植酸酶发酵条件与植酸酶分离纯化及性质的研究

王志红  
【摘要】: 醋糟是制醋工业的副产品,由于其纤维素含量高,目前的处理手段主要是将其丢弃,这样就造成了资源的浪费和环境污染。但它是一种可再利用的资源,本研究室前期研究发现,无花果曲霉(Aspergillus ficuum CGMCC 3.4322)可以利用醋糟产植酸酶。为了提高醋糟中植酸酶的产量和活性,以CGMCC 3.4322为出发菌株,筛选高产突变株,分离纯化其植酸酶,优化固体发酵条件。 试验一无花果曲霉产植酸酶菌株的诱变育种 为获得高产、高酶活的无花果曲霉(A. ficuum)突变株,通过紫外和亚硝基胍(NTG)诱变后,接种于选择性培养基(PSM)的平板中初筛,挑选透明圈直径与菌落直径比值(HC值)大于原始菌株的突变株,并在醋糟固体培养基上进行复筛。 紫外诱变法采用30 W紫外灯垂直照射10-100 s,经平板筛选后,获得49株突变株;亚硝基胍诱变法采用0.5 mg/mL的剂量,在30℃下振荡处理3-30 min,经平板筛选后,获得50株突变菌株。99株突变株经醋糟固体培养基复筛后,最终确定植酸酶活性为原始菌株活性274%的A. ficuum NTG-23突变株为后续研究对象。 试验二无花果曲霉(A. ficuum)NTG-23植酸酶的分离纯化及性质研究 本试验通过DEAE-Cellulose阴离子交换柱层析、CM-Cellulose阳离子交换柱层析、Superdex 75 Hiload 16/60凝胶过滤层析,从A. ficuum NTG-23中分离纯化得到一种分子量为65.5 KDa的植酸酶。对A. ficuum NTG-23植酸酶的酶学性质研究表明:A. ficuum NTG-23植酸酶的最适pH值为1.3-1.4;最适反应温度为65-70℃;37℃,pH值为1.3,以植酸钠为底物的Km值为0.295 mM,Vmax值为55.9 nmol/min。Ca~(2+)、Fe~(3+)、Al~(3+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)、K+、Zn~(2+)、Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Hg~(2+)对酶活性无影响,1.25-10 mM的EDTA-2Na对A. ficuum NTG-23植酸酶活性有10%左右的促进作用。A. ficuum NTG-23植酸酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶有很强的耐受性,在0.1 mg/mL,pH值为2.5条件下处理60 min后,残余的植酸酶活性仍然在90%以上。A. ficuum NTG-23植酸酶在60℃时对温度有很强的耐受性,随着作用时间的延长酶的活性增强;70℃时,作用时间超过10 min后,酶的活性降低,当作用60 min后,酶的活性仍然保持在90%以上;80℃时,作用10 min后,酶完全失活。用EDMAN降解法对A. ficuum NTG-23植酸酶N末端氨基酸序列进行检测,测序结果为:苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺(N—F S Y G A A I P Q S T Q E K Q)。N末端氨基酸序列比对结果显示:A. ficuum NTG-23 N末端氨基酸序列和A. niger NRRL 3135的PhyB序列的相似性为100%,初步判定它为酸性磷酸酶类,且是由phyB编码的蛋白。 phyB克隆测序后,经在线BLAST得到9条相似性在85%以上的phyB酸性磷酸酶序列。取其中相似性在90%以上的两条序列(DQ297678和DQ787156)进行比对,结合编码区序列(CDS)的分析显示:A. ficuum NTG-23的phyB落在它们的第一到第三段编码区;在第一段编码区中与DQ297678有3个碱基不同,与DQ787156有2个碱基不同;第二段编码区中碱基相同,第三段编码区中只有1个碱基不同。 试验三无花果曲霉(A. ficuum)NTG-23菌株利用发酵醋糟产植酸酶发酵条件的研究 为了提高植酸酶的活性和产量,对醋糟培养基进行了优化。本试验通过两水平的Plackett- Burman设计,对影响A. ficuum NTG-23发酵醋糟产植酸酶的11个因素进行筛选,得到可信度在95%以上的三个因素:葡萄糖、豆粕、发酵时间。根据PB试验结果进行回归分析后确定最速上升试验的步长,经最速上升实验,发现当葡萄糖、豆粕、发酵时间的取值分别为1.5%、0.7%、96h时,响应值(植酸酶的活性)逼近最大值区域,并确定它为下一步中心复合试验的中心点。采用响应面法对中心复合试验的结果进行分析,得到拟合回归方程: Y=67.76+4.09X_1+19.14X_2+18.53X_3-6.03X_1~2-10.88X_2~2-9.93X_3~2+3.38X_1X_2+1.06X_1X_3+7.09X_2X_3拟合回归方程的R~2 = 95.99%,失拟性检验不显著,说明方程对试验拟合可信。求方程的一阶导数并令其为零,求解得到葡萄糖、豆粕、发酵时间的取值分别为7.2%、5.1%、271h时,响应值(植酸酶活性)达到最大,将最值处的各点代入拟合回归方程,得到植酸酶活性的最值是98.19 U/g DMR,经验证试验得到此条件下植酸酶的活性是98.37 U/g DMR,说明方程代替试验真实点对试验结果的分析是可靠的,可以确定方程最值处各点的取值即为A. ficuum NTG-23利用醋糟产植酸酶的最佳条件组合。


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