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猪流感病毒感染细胞的p53蛋白变化及生物学活性分析

沈阳  
【摘要】: p53分子作为肿瘤抑制蛋白,在细胞周期调控和促进细胞凋亡等方面起到非常重要的作用。近年来研究发现,p53蛋白在细胞先天性抗病毒免疫中发挥重要的作用。Turpin等研究发现流感病毒感染细胞后诱导p53蛋白明显增加。但他们发现的p53蛋白增加是在细胞凋亡阶段。p53蛋白如何发挥抗流感病毒作用目前还不清楚。本试验的目的就是观察猪流感病毒感染MDCK细胞和Vero细胞后,p53蛋白的动态变化及其生物学活性,以探索p53蛋白抗流感病毒的可能途径。 首先,为了鉴定MDCK细胞和Vero细胞中的p53信号通路是否正常,用能够诱导p53蛋白增加的5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)处理细胞,采用western-blot和间接免疫荧光的方法,分析MDCK细胞和Vero细胞内p53蛋白的变化及其转录激活的下游基因的表达情况。结果表明,用10μM 5-Fu处理MDCK细胞和Vero细胞后,细胞内的p53蛋白增加,p53蛋白转录激活的Bax、IRF9的表达也相应增加。因此,猪流感病毒敏感的MDCK细胞和Vero细胞的p53蛋白的信号通路是正常的,可以用于下一步的试验。 为了观察猪流感病毒感染细胞后p53蛋白的动态变化,在猪流感病毒感染MDCK和Vero细胞后不同时间收集细胞样品,用western-blot方法检测细胞内p53蛋白的变化情况。并用热灭活的猪流感病毒和紫外线灭活的猪流感病毒感染MDCK细胞,探索p53的动态变化是否与细胞的复制有关。同时,用半定量RT-PCR法检测p53 mRNA的变化情况。结果表明,猪流感病毒感染MDCK细胞后,在感染后1-3h p53蛋白增加,3-10h p53蛋白表达下降,10-16h后p53蛋白的表达又明显增加。猪流感病毒感染Vero细胞后也出现相似的变化趋势,在感染后4-8h p53蛋白表达增加,8-14h p53蛋白表达下降,14-18h后p53蛋白的表达又明显增加。用热灭活的猪流感病毒感染MDCK细胞后,p53蛋白的变化不明显,而用紫外线灭活的猪流感病毒感染MDCK细胞后p53蛋白呈现与用未灭活猪流感病毒感染MDCK细胞的p53蛋白第一次增加相似的变化。在p53蛋白的变化过程中,p53的mRNA变化不明显。因此,猪流感病毒感染细胞后引起p53蛋白两个阶段增加,这种变化趋势与猪流感病毒在细胞中的复制有关,而与p53基因的转录没有关系。 为了证实猪流感病毒诱导的细胞内的p53蛋白是否具有转录激活活性。用western-blot方法检测p53转录激活的下游基因Bax和IRF9基因的表达情况。同时,用特异性抑制p53活性的α-pifithrin处理细胞后再感染猪流感病毒,检测Bax和IRF9表达的变化情况。结果表明猪流感病毒诱导的Bax和IRF9的表达与p53蛋白的变化趋势是一致的,p53蛋白增加Bax和IRF9的表达也增加,p53蛋白减少Bax和IRF9的表达也减少。用α-pifithrin处理的细胞中,Bax和IRF9的表达变化不明显。因此,猪流感病毒诱导的细胞内的p53蛋白具有转录激活活性。 为了阐明猪流感病毒感染细胞后增加的p53蛋白与猪流感病毒复制阶段的关系,我们用western-blot和测TCID50方法分别检测猪流感病毒感染Vero和MDCK细胞后不同时间点病毒蛋白NS1的表达和细胞培养液中病毒的滴度。研究结果表明,猪流感病毒感染Vero细胞后10h开始能检测到病毒蛋白NS1,有少量的病毒出现,此时对应于p53蛋白下降阶段。猪流感病毒感染MDCK细胞后6h开始能够检测到病毒蛋白NS1,有少量病毒产生,此时也对应于p53蛋白下降阶段。所以我们认为,猪流感病毒感染细胞后p53蛋白的第一次上升处于病毒复制的早期阶段,p53蛋白第二次增加处于病毒复制的中后期。 为了探索p53蛋白是否有抗猪流感病毒的作用,我们用RNAi干扰技术建立p53knock down MDCK细胞系,观察猪流感病毒在p53 knock down MDCK细胞系中的复制情况;并用流式细胞术分析猪流感病毒感染细胞后,细胞凋亡情况和细胞周期的变化情况。观测发现猪流感病毒在p53 knock down MDCK细胞中的病毒滴度增加。猪流感病毒感染MDCK细胞后,在病毒感染的早期阶段细胞周期的变化不明显,在病毒感染的中后期细胞发生凋亡。结果表明,p53蛋白具有抗猪流感病毒的作用。猪流感病毒感染MDCK细胞引起的p53蛋白的第一次上升与细胞周期的调节没有关系,可能与p53通过IFN通路途径发挥抗病毒作刚有关。p53蛋白的第二次上升与细胞的凋亡有关。 总之,本论文首次发现了猪流感病毒感染细胞后诱导p53蛋白呈现两次增加。p53蛋白的第一次增加发生在病毒复制的早期阶段。增加的p53蛋白与细胞周期调节没有关系,但具有转录激活活性,能够转录激活IFN调节因子9(IRF9)。在此阶段,激活的p53蛋白可能通过IFN途径抑制流感病毒的复制。p53蛋白的第二次增加发生在猪流感病毒复制的中后期,增加的p53蛋白与细胞凋亡有关。


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