醋酸钙不动杆菌PHEA-2苯酚降解调控蛋白MphR的功能分析

【摘要】： 苯酚是工业排污中一种广泛存在的污染物,苯酚的生物降解以及降解基因的表达调控机制的研究受到世界各国的高度重视。本研究在分离一株高效苯酚降解菌,醋酸钙不动杆菌PHEA-2和克隆到苯酚降解基因簇(mph)的基础上,采用反向PCR,启动子-lacZ融合基因转录分析,引物延伸法,凝胶阻滞以及坐滴法结晶蛋白等方法,开展了醋酸钙不动杆菌PHEA-2苯酚降解调控蛋白MphR的功能和结构分析,以及mph基因簇表达调控机制的研究。 克隆了苯酚降解调控基因mphR,基因序列长1671bp,编码556个氨基酸,预测蛋白分子量为63 kDa。序列分析表明MphR是XylR/DmpR家族调控蛋白,与醋酸钙不动杆菌NCIB8250的苯酚降解调控蛋白MopR的氨基酸同源性是69.11%。通过转录活性分析实验证明了MphR为苯酚羟化酶基因的正调控蛋白。另外,制备了MphR的蛋白晶体,为解析XylR/DmpR的蛋白结构奠定了基础。 为了研究MphR对苯酚降解的调控作用,我们对mphR和mphK基因起始密码子之间的序列进行分析,发现这段序列含有σ70型的mphR基因的启动子(PmphR)和σ54型(又被称为-24/-12型)的mphK基因的启动子(PmphK)。通过引物延伸法确定了mphK基因的转录起始位点是mphK起始密码子ATG上游40个碱基处的G碱基。PmphK上游含有三个反向重复序列(IR1, IR2和IR3)和一个推测的整合宿主因子(IHF)的结合位点。构建一系列截短的PmphK::lacZ融合表达载体,在大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶酶活测定结果显示,IR1缺失的PmphK在2mM苯酚诱导时的β-半乳糖苷酶酶活提高了大约240%,因此认为IR1对PmphK的转录活性有抑制作用。IR1缺失的全细胞生物检测菌PEMRP34对低浓度苯酚(0.1-5μM)的检测灵敏性比对照菌株(PEMRP14)提高了100%。IR2缺失的PmphK失去转录活性,说明IR2是PmphK发挥转录功能所必不可缺少的,因此推测IR2和IR3是MphR在PmphK上的结合序列(又被称为上游激活序列UAS)。含有PmphK::lacZ融合表达质粒pGDP的PHEA-2菌中,PmphK::lacZ转录分析显示在21种酚类衍生物中苯酚,邻甲酚,间甲酚,邻氯苯酚等9种酚类衍生物可以作为MphR的效应物激活PmphK的转录。PmphR::lacZ转录融合子分析发现mphR基因在PHEA-2菌中组成型表达,而且mphR基因对其自身转录有激活作用。 凝胶阻滞实验进一步研究了MphR蛋白与PmphK之间的相互作用关系,研究结果表明His-MphR蛋白在体外能和苯酚羟化酶基因的启动子结合,结合区域是IR2和IR3。将His-MphR蛋白分别和IR1,IR2和IR3进行凝胶阻滞试验发现,MphR蛋白可以分别与IR2和IR3结合,与IR2序列的结合能力最强。