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猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

李海忠  
【摘要】: 单克隆抗体技术是1975年由G. Kohler和C. Milstein创立的,其基本原理是通过细胞融合技术,使B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞继承两种亲本细胞的特性,既具有B淋巴细胞分泌专一抗体的能力,也具有骨髓瘤细胞体外无限生长繁殖的能力。由于单克隆抗体纯度较高,具有良好的特异性、重复性,因此,在免疫学、细胞生物学,医学、微生物学等领域得到广泛应用,尤其在兽医研究中,更成为不可或缺的基础工具。 与猪圆环病毒(Porcine cirovirus,PCV)感染相关的疾病,统称为猪圆环病毒病(Porcine cirovirus disease, PCVD),近年来普遍发生的主要有:断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS) ,猪皮炎和肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS),猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex , PRDC) , PCV2相关的繁殖障碍综合征(PCV2-associated reproductive failure syndrome)。PCVD的广泛流行,严重危害养猪业发展。 PCV属于圆环病毒科(Circoviridae),圆环病毒属(Cirvovirus),病毒粒子直径大小约为17 nm,无囊膜,呈20面体对称。基因组为一条环状、单股DNA。根据基因组的差异,PCV可以分为2种亚型:PCV1,基因组全长为1759 bp;PCV2,基因组全长为1768 bp或1767bp。两个主要的读码框ORF1和ORF2,其中ORF1由945个碱基组成,编码病毒的复制蛋白,ORF2由705个碱基组成,编码病毒的主要结构蛋白-核衣壳蛋白,具有良好的免疫原性,可以刺激机体产生保护性抗体。 本实验应用已构建的基因工程重组菌NLS-Cap M15,通过IPTG诱导,原核表达Cap蛋白,经亲和层析纯化后,紫外分光光度计测得纯化后的蛋白浓度是1.2mg/mL。将纯化的蛋白与弗氏佐剂混合乳化后,按照100μg/只免疫6周龄的BALB/c小鼠3次,每次免疫间隔两周。第三次免疫后,小鼠阳性抗体效价可达1:10000以上,剖杀小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,PEG作为融合剂,ELISA方法筛选,获得了3株阳性杂交瘤细胞,分别命名为2C3、2F3、1E10。 用秋水仙素处理杂交瘤细胞株,经过固定和染色,在显微镜下观察杂交瘤细胞,所获杂交瘤细胞的染色体数在95~103之间,染色体数目远远大于任一亲本细胞的染色体数,可以直接的判定,经过亚克隆所获得细胞是阳性杂交瘤细胞。将获得的阳性杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔,制备腹水,ELISA检测其腹水效价均达到1.0×105。单抗亚型鉴定试验结果表明,2C3、2F3均属于IgG1型,1E10属于IgG2a型,轻链都是κ链。Western blot表明,获得的3株单抗均可以特异识别Cap蛋白。将PCV2病毒感染PK-15细胞,经丙酮固定后,用制备的3株单抗做间接免疫荧光实验,结果表明单抗2C3、2F3、1E10反应均为阳性,表明这3株单抗能够识别PCV2病毒。 应用本实验构建的真核表达全长Cap蛋白的质粒pCA-Cap和表达去核定位信号Cap蛋白的质粒pCA-TCR分别转染293T细胞。72h小时后,多聚甲醛固定,单抗作为一抗孵育2h,FITC-IgG羊抗鼠二抗孵育1h,PI染料对细胞核染色5min,在共聚焦显微镜下观察。结果显示,Cap蛋白主要在分布在细胞核中,而去核定位信号肽的Cap蛋白主要分布在细胞质中。 本实验成功制备了3株抗PCV2 Cap蛋白的单抗,并用制备的单抗在Cap蛋白的亚细胞定位方面进行了初步应用。制备的单抗为今后建立PCV2的诊断方法和研究PCV2的抗原表位奠定了基础。


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