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黄瓜离体再生和遗传转化体系的建立

张若纬  
【摘要】: 黄瓜是国内外广泛种植的一类重要蔬菜作物,在蔬菜周年化供应中具有重要作用,实际生产栽培中常因各种病虫的危害造成巨大的经济损失。由于传统病虫害防治方法的种种不利因素,因此,选育抗性品种从根本上提高黄瓜抗病虫能力,是防治的最佳途径。但是黄瓜种内抗性材料缺乏,传统育种很难获得突破。本研究以不同材料的黄瓜子叶、子叶节作外植体,研究了基因型、激素对黄瓜离体分化的影响,建立了高效的离体再生体系;同时研究了AS、侵染时间、PH值对黄瓜遗传转化的影响,优化了转化体系;在此基础之上,通过根癌农杆菌介导法,将GUS基因导入黄瓜,对转化体系进行了初步探索,并进一步将抗线虫基因MiMPK1导入黄瓜,为黄瓜遗传转化的相关研究提供理论依据。 主要研究结果如下: 1.基因型是植物离体再生能力高低的重要影响因素之一,不同基因型之间的再生能力差异很大。黄瓜子叶再生体系建立所用的6份材料(中农8号、吉林旱瓜选系、四川白瓜选系、Gy14、65G、9110Gt)中,华南类型材料吉林旱瓜的再生能力最强,在培养基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO_3上,再生频率和每外植体再生芽数分别为96.7 %和5.2;黄瓜子叶节再生体系的建立所用的8份材料(吉林旱瓜选系、四川白瓜选系、0513、228、Gy14、65G、185、K2148)之中,华南类型材料四川白瓜的再生能力最强,在培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO_3上,再生频率和每外植体再生芽数分别为100 %和6.4。 2.植物激素是植物离体再生所必需,6-BA是黄瓜离体分化中最常用的植物激素之一。对于黄瓜子叶外植体的分化而言,6-BA是不定芽发生的主导因素,而ABA的添加能显著提高不定芽数目。美国加工类型材料Gy14和欧洲华北混合类型材料9110Gt的最佳诱芽培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA+2 mg/L AgNO_3;华南类型材料吉林旱瓜和四川白瓜的最佳诱芽培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO_3;欧洲温室类型材料65G的最佳诱芽培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L ABA+2 mg/L AgNO_3;华北类型中农8号最佳诱芽培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA+2 mg/L AgNO_3。对于黄瓜子叶节外植体的分化而言,培养基中仅附加6-BA即可得到很好的再生效果,不同材料对激素的敏感程度不同。材料228、185、65G的最佳诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO_3;材料四川白瓜、吉林旱瓜、K2148、0513的最佳幼芽培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO_3;GY14的最佳幼芽培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO_3。 3.在黄瓜再生体系建立的基础之上,研究了子叶节对Km和Hyg的耐受性和敏感度,确定了含不同抗性基因载体的筛选剂浓度,Km的选择压为75 mg/L,Hyg的选择压浓度为10 mg/L。 4.黄瓜遗传转化体系优化的结果表明,在预培养基、菌液、共培养基中添加AS能显著提高抗性芽数量,最佳浓度分别为250 ul/L、500 ul/L、250 ul/L;侵染时间为15 min时,外植体再生频率和抗性芽数最高;选择培养基pH较低时有利于外植体分化,以PH=5.40最佳。 5.采用根癌农杆菌介导法将GUS基因转化黄瓜,对转化体系作初步探索。得到了Km抗性植株,取幼嫩叶片,经GUS组织化学染色,共有14株显示蓝色,表明GUS基因已整合到黄瓜基因组,并实现表达,初步统计阳性率为7.4 %。 6.在遗传转化体系的优化和探索的基础之上,将抗线虫基因MiMPK1导入黄瓜,筛选获得了Hyg抗性植株。提取抗性植株的基因组DNA,经PCR检测,共有28株扩增出500 bp左右的特异条带,初步统计阳性率为5.3 %,为黄瓜的抗线虫病育种提供了理论依据。


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