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耐砷真菌的分离鉴定及其砷累积与挥发机理

苏世鸣  
【摘要】: 利用微生物对砷(As)的累积与挥发来降低土壤中砷的环境风险已被认为是一种经济、有效且无二次污染的修复措施。近年来许多研究者在相关方面做了有益的探索,但从总体看,具有高累积与挥发砷能力真菌的报道还较少,真菌累积与挥发砷机理的研究还处于理论阶段。因此本研究首先采集了砷污染土壤,从中分离、筛选出耐砷真菌,经鉴定后研究了真菌对砷的累积与挥发能力,最后探讨了其可能机理。取得如下主要结果: 1.稀释涂布法对耐砷真菌进行了分离。结果表明,6个土壤样品中共分离得到13株耐砷真菌,其中,菌株SM-12F1、SM-12F4和CZ-8F1分别在20000、30000、30000 mg·L-1砷胁迫下表现出更好的菌落生长状况;液态培养2d后,当As (V)浓度分别为50、80、50 mg·L-1时,SM-12F1、SM-12F4、CZ-8F1的生物量显著高于不加砷的对照。此外,As (V)并没有影响该三株真菌的产孢能力;扫描电镜(SEM)分析表明,As (V)并没有影响菌株SM-12F1、SM-12F4、CZ-8F1的菌丝生长,该三株真菌具有较高的耐砷能力。 2.形态学与基于18S rRNA的分子生物学方法进行了菌株的鉴定。结果表明,真菌SM-12F1、SM-12F4和CZ-8F1的菌落形态、产孢结构等均分别与棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、微紫青霉(Penicillin janthinellum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的特征形态相同;系统发育树分析表明,SM-12F1、SM-12F4和CZ-8F1分别与T. asperellum、P. janthinellum和F. oxysporum在同一发育枝上,相似度分别为99%、96%和99%;序列递交GenBank后,该三株真菌获得登陆号分别为GU212867、GU212865、GU212866。 3.室内条件下研究了真菌对砷的累积与挥发能力。结果表明,T. asperellum SM-12F1、P. janthinellum SM-12F4和F. oxysporum CZ-8F1均具有一定的累积与挥发砷能力,当培养液中As (V)含量为2500μg,浓度为50 mg·L-1时,SM-12F4在培养10d时表现出最高的砷累积能力,砷累积量为39.54μg,而CZ-8F1在培养时间为15d时表现出最高的砷挥发能力,砷挥发量为304.06μg;菌株SM-12F1和CZ-8F1细胞壁外吸附砷和胞内累积砷的含量分别占其总累积砷量的82.2%和63.4%,而SM-12F4在细胞内与细胞壁外累积的砷含量比例大约相同;浸有AgNO3的滤纸吸附砷实验表明,砷在处理(滤纸+砷+菌)中的含量均显著高于对照(滤纸+砷、滤纸+菌、滤纸),该结果进一步证实了三株真菌对砷的挥发能力。 4.高效液相-氢化物发生-原子荧光(HPLC-HG-AFS)分析了真菌培养液及细胞内砷形态的变化。结果表明,培养2-3d后,T. asperellum SM-12F1、P. janthinellum SM-12F4和F. oxysporum CZ-8F1培养液中的As (V)全部转化为As (III);各培养时间下,三株真菌细胞内砷形态均以As (V)为主,当培养时间为15d时,SM-12F1细胞内可检测到少量的As (III)、MMA(一甲基砷)、DMA(二甲基砷),真菌细胞内存在着无机砷向甲基态砷的转化;培养液中pH、Eh随着培养时间的变化表明,As (V)向As (III)的转化主要发生于真菌细胞内,培养环境中Eh的变化并不是As (V)向As (III)转化的原因。培养7d后,SM-12F1和CZ-8F1培养液中pH分别为6.69和8.38,而SM-12F4培养液中pH为3.78,酸性的培养环境可能促进了无机砷在真菌细胞壁上的吸附。


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