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参与番茄花柄离区发育的转录因子SPL3的基因功能研究

陈晓博  
【摘要】: 器官脱落(abscission)是植物细胞、组织或器官脱离母体的生理过程,器官脱落发生的特定的区域叫做离区(abscission zone)。番茄(Solanum lycopersicum)以其独特的花柄离区结构成为研究器官脱落的理想模式植物。虽然目前已经分离得到了一些影响番茄花柄离区发育相关的基因,如:JOINTLESS(J)、JOINTLESS2(J2)和LATERAL SUPPRESSOR(LS)等,但是关于离区发育的分子机制还是知之甚少。其中,J在番茄花柄离区发育中发挥决定作用。J属于MADS-box基因家族,该基因家族成员参与植物花器官发育,开花时间调控等多个生长发育过程。已有研究表明,SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE(SPL)基因编码植物所特有的转录因子,对不同MADS-box基因亚家族成员表达均有影响。SPL转录因子参与包括花和果实发育,植株形态建成等多种发育过程。本实验通过酵母单杂交方法筛选J直接调控基因,并利用反向遗传学手段对它们进行了较为详细的分析。主要研究结果包括: 一.本实验分离得到了一个能够直接结合J启动子的SPL类转录因子LeSPL3。以J启动子序列为靶序列,通过酵母单杂交筛选花序分生组织cDNA文库。对筛选得到阳性克隆测序分析,发现5类已知基因家族的转录因子,根据拟南芥同源基因将其中植物所特有的4个转录因子分别命名为:LeSCL3、LeSPL3、LeREV和LePHA。克隆这四个转录因子,与J启动子区域进行体外酵母单杂交互作验证,结果均为阳性。由于J启动子区域带有SPL转录因子保守结合序列,因此对LeSPL3转录因子与J启动子上游顺式作用元件结合通过凝胶组织实验和免疫共沉淀进行进一步分析,确定LeSPL3可以结合J上游顺式作用元件TCTGTACAA,是J上游调控基因。 二.利用拟南芥和烟草(Nicotiana tabacum)系统研究了LeSPL3在离区和花柄发育中的作用。根据酵母单杂交筛选得到的LeSPL3基因序列,设计引物,克隆得到了全长LeSPL3基因。LeSPL3和其拟南芥同源基因AtSPL3氨基酸序列同源性为69.1%,基因结构类似:由2个外显子和1个内含子组成,3’UTR区域带有小分子RNA miR156/157识别位点。组织特异性分析表明LeSPL3在番茄花序和花柄中的表达量远远高于其他组织,说明LeSPL3可能主要在番茄花器官发育和花柄发育过程中发挥作用。(2)构建LeSPL3基因过表达载体,分别转化拟南芥与烟草进行正向遗传学分析。转基因烟草植株花易脱落,花柄离区离层细胞层数增加,说明LeSPL3基因可能影响到花柄离区发育。另外转基因烟草还出现花柄变细,花柄细胞变小等表型,说明LeSPL3可能对花柄发育也有一定的影响。转基因拟南芥和烟草均表现出叶片卷曲、早花等表型,与拟南芥AtSPL3基因过表达表型类似,说明LeSPL3与AtSPL3功能保守,参与叶片发育和植株开花时间调控。 三.比较了烟草正源基因NtSPL3与LeSPL3的功能异同。通过序列比对和已有的烟草序列信息,克隆得到了烟草中的NtSPL3基因。氨基酸序列分析显示NtSPL3和LeSPL3具有94%的同源性。NtSPL3基因影响烟草花柄离区发育,表现为过表达烟草植株花柄离区离层细胞层数增加,而RNAi植株花柄结构不明显。NtSPL3过表达植株也表现出早期叶片卷曲,早花。说明NtSPL3在影响烟草植株叶片发育和开花时间调控中的功能相似。同时发现,转基因植株气孔数目发生明显变化,过表达植株气孔数目减少至野生型的一半,RNAi植株气孔数目则增加一倍以上。这一结果表明NtSPL3可能在烟草气孔细胞分化过程中发挥重要作用。 综上所述,本研究获得了直接调控番茄离区发育基因JOINTLESS的上游调控因子LeSPL3,证明其参与植物花柄和花柄离区发育过程,从而延伸了离区发育的分子调控路径。另外,NtSPL3可能具有更为广泛的作用,尤其是它对气孔细胞的发育的影响,暗示着NtSPL3在功能上与番茄了SPL3相比有更大的分化,可能在植物抗旱中发挥一定的作用。本研究所揭示的关于离区发育分子机制对农业生产中通过减少果实脱落来提高产量有潜在应用价值。


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