狂犬病Flury病毒致弱分子机制及新型疫苗的研究

【摘要】： 狂犬病(rabies)是一种在全世界范围内流行的,由狂犬病病毒(rabies virus, RV)引起的以中枢神经系统感染(CNS)为特征的人畜共患病。全世界每年死于狂犬病的人数高达55,000,主要发生在发展中国家。目前,狂犬病无法治疗,一旦发病致死率几乎为100%。疫苗免疫是控制狂犬病唯一有效的方法。为研制更加安全、有效的狂犬病疫苗,迫切需要加强对RV病原致病分子机制与免疫机制的基础研究。 I. RV Flury传代致弱的分子机制的研究 1940年,Koprowski等人从病死女孩脑内分离到狂犬病毒Flury株,经1日龄雏鸡脑内、鸡胚卵黄囊传后,再经鸡胚传代178代以上,无论神经内、外接种都对动物丧失致病力,但新生乳鼠和猴在脑内接种时仍有感染性。在鸡胚传代68代以前的称为“LEP”(鸡胚低代株);高于136代的称为“HEP”(鸡胚高代株)。LEP脑内感染成年小鼠致死,而HEP脑内感染成年小鼠不致死。造成LEP和HEP致病力生物学表型差异的分子机制仍未充分阐明。本研究拟就RV Flury传代致弱的分子机制进行系统研究。 对LEP和HEP完整基因组的系统解析表明,LEP和HEP的基因组均含有11,925个核苷酸,相似性达99.3%。LEP和HEP的L基因ORF核苷酸相似性最高为99.7%,N基因(99.6%)、P基因(99.4%)、M基因(99.3%)和G基因(98.9%)依次降低。两株病毒由N、P、M、G和L基因ORF预测的氨基酸序列相似性分别为99.8%、98.3%、99.0%、97.8%和99.6%。比较这两个毒株的5个蛋白的氨基酸序列,共有27个氨基酸发生改变,变化最大的是G蛋白,最保守的是N蛋白。N/P、P/M和M/G间的基因间隔序列完全一致,G/L间的间隔序列仅有一个碱基发生突变。另外,3’、5’端的非编码区及所有基因的转录起始信号和终止信号序列也都一致。 在此基础上,建立了Flury LEP和HEP的反向遗传操作系统。从cDNA克隆拯救获得的rLEP在小鼠神经母细胞(NA)和BHK-21细胞上的多步生长动力学曲线与野生型毒株相似,最高生长滴度分别可达3.0×10~8 FFU/ml和5.0×10~7 FFU/ml,体外嗜神经指数为0.78。rLEP通过脑内(i.c.)、滴鼻(i.n.)及肌肉注射(i.m.)不同途径分别感染成年小鼠均致死,LD50分别1 FFU,474 FFU和3.4×10~5 FFU,与野生型毒株相近。从cDNA克隆拯救获得的rHEP在NA和BHK-21细胞上的多步生长动力学曲线与野生型毒株相似,最高生长滴度均可达2.0×10~7FFU/ml,不具备体外嗜神经性,通过i.c.、i.n.及i.m.不同途径分别感染成年小鼠均不致死,表现出与野生型HEP相似的生物学特性和致病力。 将HEP的G333位的Gln突变为Arg,形成的突变株rHEPG333R体外嗜神经指数由0变为0.8,与LEP相近,表明rHEPG333R已经回复了嗜神经特性。通过i.c.,i.n.和i.m.3种不同途径分别感染小鼠,rHEPG333R均可使小鼠致死,LD50分别为0.3 FFU、887 FFU和1.4×10~6 FFU。结果表明,G333位点的Arg单个氨基酸突变足以使HEP重新获得对成年小鼠的高致病力。 但是,将LEP的G333位点由Arg突变为Gln后,形成的rLEPG333Q突变株尽管体外嗜神经指数下降为0,肌肉接种小鼠全部存活并且无神经症状出现,但通过i.c.或i.n.途径感染小鼠时,rLEPG333Q对小鼠仍显示出高度致死性,LD50分别为36 FFU和2.1×10~5 FFU。结果提示,G333 Arg的替换突变消除了LEP的嗜神经性和外周神经侵入能力,但i.c.或i.n.感染成年小鼠仍保持其高致死力。进一步对rLEPG333Q接种致死小鼠脑内病毒基因组序列进行分析,结果发现,rLEPG333Q在小鼠脑内和NA细胞中复制时,G333位点的Gln人工突变不能保持稳定,发生了嗜神经性的回复突变,因而重新获得对小鼠的致死能力。相反,rHEP无论经i.c或i.n.接种,还是NA细胞连续传代,G333位点的Gln均未发生回复突变。 为了澄清影响G333Q突变在神经组织或细胞复制过程中遗传稳定性的因素,进一步构建了嵌合病毒rHEP-G(L)333Q和rLEP-G(H),前者通过将HEP的G基因替换为LEP的G基因,同时G333位点Arg突变为Gln构建而成的,后者通过将LEP的G基因替换为HEP的G基因构建而成的。rHEP-G(L)333Q体外嗜神经指数也和rHEP一样,仍然为0;经i.c.感染小鼠不致死,病毒在小鼠脑内和NA细胞上复制时G333位点的Gln稳定不变。而嵌合病毒rLEP-G(H),在NA细胞上的生长性能显著地低于rLEP,而与rHEP十分接近;体外嗜神经指数也下降为0。尽管如此,小鼠经i.c.接种105 FFU的rLEP-G(H)后,在感染后12天内全部死亡。提取濒死小鼠脑组织RNA和NA细胞传代的第5代培养物进行RT-PCR和测序分析发现,rLEP-G(H)的G333位点Gln(CAG)已经突变为Arg(CGG)。结果表明,造成rHEP和突变株rLEPG333Q在神经组织或细胞中复制时G333位点Gln的遗传稳定性存在差异是LEP基因组骨架上的某个(或某些)因素而不是G蛋白本身引起的。 负链RNA病毒的RNA聚合酶的低保真性是病毒突变最主要的原因。为此,将rLEPG333Q的L基因替换为HEP的L基因,构建了嵌合病毒rLEPG333Q-L(H)。成年小鼠脑内接种105 FFU的rLEPG333Q-L(H)全部存活且没有出现神经症状,rLEPG333Q-L(H)的G333位点Gln(CAA)在鼠脑和NA细胞传代时稳定不变。结果表明,L蛋白与G333位点的Gln突变的遗传稳定性密切相关。L基因与G基因的协同变异、进化导致Flury在鸡胚传代过程获得致弱。 同时,我们还研究了GR333Q突变对Flury诱导细胞凋亡能力的影响。结果发现,rLEP和rHEPG333R感染的NA细胞中,NA细胞发生凋亡的比例分别为2.9±0.7%和2.8±0.6%,与空白对照组的细胞凋亡水平相似(2.6±0.6 %)。相比之下,rHEP、rLEPG333Q、rHEP-G(L)333Q和LEPG333Q-L(H)诱导的凋亡水平则高于对照组,分别为对照组的2.1、2.4、2.1和2.1倍。进一步利用western blot分析比较在病毒感染的细胞中不同蛋白的表达水平。结果发现,rLEP与rLEPG333Q、rHEP-G(L)333Q或rLEPG333Q-L(H)相比,G蛋白表达水平无明显差异;rHEP与rHEPG333R的G蛋白表达量也十分相近。结果显示,Flury病毒诱导NA细胞凋亡能力与G蛋白的表达量并无一定相关性。这一结果与前人报道G蛋白的表达量与凋亡诱导水平呈正相关的结果有所不同,提示狂犬病病毒诱导神经细胞凋亡的分子机制仍然有待进一步研究。 嵌合病毒rHEP-G(L)333Q和rLEPG333Q-L(H)高度致弱,失去嗜神经特性,并且遗传稳定。对小鼠的免疫和攻毒试验结果显示:rHEP-G(L)333Q和rLEPG333Q-L(H)免疫小鼠无论诱导的RV中和抗体水平,还是对街毒攻击的保护效力,均显著高于LEP和HEP,具有开发成为分子修饰弱毒疫苗的潜力。 II.狂犬病灭活疫苗的研制 RV灭活疫苗在生物安全性上具有突出优势,但是制造成本高,价格相对昂贵,免疫期相对较短,在发展中国家特别是农村地区难以推广应用。提高灭活疫苗抗原的单位生产效率,将有助于降低生产成本,同时提高免疫效力,延长疫苗接种间隔期。 本研究构建了表达双重G蛋白基因的重组RV Flury LEP病毒株rLEP-G。生物学特性分析显示,rLEP-G在NA和BHK-21细胞的生长滴度分别可达7.0×10~8 FFU/ml和1.0×10~8 FFU/ml,体外嗜神经指数为0.85,与LEP相近。rLEP-G通过i.c.接种感染小鼠的LD50为1 FFU,与LEP的致病性无显著差异。Western blot结果显示,rLEP-G感染BHK-21细胞后G蛋白的表达量显著提高3倍。分别以rLEP-G和LEP为种毒,按相同细胞培养量制备成灭活疫苗,对进行小鼠和比格犬的免疫效力试验。结果表明,无论小鼠还是比格犬,rLEP-G灭活疫苗诱导RV中和抗体的能力均显著高于LEP灭活疫苗,表现出良好的免疫原性,适用于狂犬病灭活疫苗的开发。