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云斑天牛胃肠道内共生细菌来源的纤维素酶和半纤维素酶的初步研究

周峻沛  
【摘要】: 纤维素酶及半纤维素酶在多种工业领域,包括在饲料工业中都具有巨大的应用价值。天牛幼虫以木材为食,是研究纤维素酶及半纤维素酶的高价值材料。胃肠道内共生细菌蕴藏着丰富多样的纤维素酶及半纤维素酶,但天牛胃肠道细菌来源纤维素酶及半纤维素酶的相关报道却极为有限。 本研究使用简并引物同源克隆的方法,从云斑天牛(Batocera horsfieldi)幼虫胃肠道分离培养的34株细菌中,总共获得26个纤维素酶或半纤维素酶编码基因片段,包括糖苷水解酶(GH)第3家族β-葡糖苷酶、48家族纤维二糖水解酶、10和11家族内切木聚糖酶、52家族β-木糖苷酶、67家族α-葡糖醛酸糖苷酶、16家族β-葡聚糖酶、2家族β-半乳糖苷酶和36家族α-半乳糖苷酶。同时,从云斑天牛幼虫胃肠道环境基因组中直接获得了纤维素酶和半纤维素酶编码基因片段,包括第5和45家族内切纤维素酶,48家族纤维二糖水解酶,10家族内切木聚糖酶,39和52家族β-木糖苷酶和67家族α-葡糖醛酸糖苷酶。选取第5和第10家族的氨基酸片段进行多样性分析,Shannon指数分别为2.68和2.09。系统发育分析指出这些氨基酸序列可能并不来源于多样的细菌门类,而主要是源于单个细菌门下的多样的细菌属或种类。通过与松墨天牛(Monochamus alternatus)虫洞环境、瘤胃和白蚁胃肠道来源序列的比较分析(第10家族序列仅与虫洞环境序列比较),揭示了云斑天牛胃肠道环境第5和第10家族的氨基酸序列的特异性(p0.001)。 改进了常规热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)方法以使操作更简便、更高效,同时建立了针对鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量高的基因的GC TAIL-PCR方法,结果获得了由25个基因构成的木聚糖和木糖代谢染色体片段、6个纤维素酶或半纤维素酶编码基因和2个高GC含量(xynA119中GC含量为67.8%,xynB119中GC含量为67.3%)的木聚糖酶基因。选取其中11个酶作进一步研究,包括来源于Sphingobacterium sp. TN111的第16家族β-葡聚糖酶GluA111,Serratia sp. TN49的第3和家族β-葡糖苷酶BglA49,Sphingobacterium sp. TN19的2个第10家族内切木聚糖酶XynA19和XynB19、43家族α-阿拉伯呋喃糖苷酶Gh43A19和36家族α-半乳糖苷酶GalA19,Streptomyces sp. TN119的第10和11家族内切木聚糖酶XynA119和XynB119,Sphingobacterium sp. TN105的第2家族β-半乳糖苷酶BgaA105和36家族α-半乳糖苷酶GalA105及Flavobacterium sp. TN17的第36家族α-半乳糖苷酶GalA17。这11个酶与数据库中已发表序列的氨基酸序列最高一致性为38.8–80.1%。系统发育分析发现内切木聚糖酶XynA19和α-半乳糖苷酶GalA17与其同分类地位细菌来源的序列亲缘关系较远,而与胃肠道共生细菌来源的序列相近;但第3家族β-葡糖苷酶BglA49却未具有这样的特征。进一步的分析发现胃肠道环境共生细菌来源的第36家族α-半乳糖苷酶具有潜在催化域KWD和SDXXDXXXR,不同于已知具有晶体结构的α-半乳糖苷酶催化域KXD和RXXXD。突变分析表明KWD中的D480,SDXXDXXXR中的S548、D549和R556是GalA17具有酶活的必要氨基酸,其中,D480和D549可能是催化残基。 将上述11个酶编码基因都重组到pET载体,并转化到Escherichia coli BL21(DE3)中表达,除了GluA111未能检测到活性外,其余10个都检测到了相应的酶活。利用组氨酸标签纯化了重组的XynA119、XynB119、XynA19、BglA49及GalA17。对这些纯化酶进行酶学性质测定,结果显示:最适pH都在中性范围内(pH5.5–7.5),pH稳定性在中性pH内最佳,最适温度较低(35–60°C),热稳定性较差(低于50°C但都能在37°C稳定)。这些共同特征可能与天牛生存环境及肠道生理环境密切相关。同时,GalA17具多种蛋白酶抗性(胰蛋白酶、胶原蛋白酶、α-糜蛋白酶和蛋白酶K);XynB119在很宽的pH范围内稳定(pH1.0–11.0)并对多种蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶、α-糜蛋白酶和蛋白酶K)有抗性;XynA19在低温具有活性(10°C时~40%的活性),同时具有低温内切木聚糖酶中相对较好的热稳定性(40°C稳定);BglA49也在低温具有活性(10°C时酶活20%);与嗜热或中温第10家族内切木聚糖酶和第3家族β-葡糖苷酶结构相比,XynA19和BglA49在结构上的离子键和氢键数量大幅降低。GalA17、XynB119、XynA19和BglA49的性质特点使其在食品和饲料添加剂方面具一定的应用潜力。 本文首次研究了云斑天牛胃肠道这一特殊生态环境中共生细菌来源的纤维素酶和半纤维素酶,从酶的多样性、系统发育、高级结构和酶学性质方面进行了相关探讨,增进了对食木昆虫胃肠道内的纤维素酶和半纤维素酶的基础认识,发掘了具有应用潜力的纤维素酶及半纤维素酶。


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