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两株新城疫病毒分离株全基因组序列的测定及在CEF和鸡胚传代的含量变化分析

孙委委  
【摘要】: 新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(ND virus, NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性和致死性传染病。对养禽业造成很大的经济损失。新城疫在世界范围共引起4次大流行,每次大流行都有新的基因型产生,现在世界范围都普遍采用疫苗接种的方法预防新城疫,但在免疫鸡群中还时有发生,该病毒宿主范围很广,但在新城疫最开始爆发时期,在水禽体内只是隐性感染,并不致病,但自1997年在我国南部多数省份的鹅体内分离到的强毒株并引起鹅死亡,现在从鸡体内分离到的新城疫病毒很多和水禽源的新城疫病毒的亲缘关系很高,对水禽的新城疫的预防免疫也不容忽视。 本研究于2008年在山东鸡场某免疫鸡群发病鸡体内分离到的病毒,经病毒的分离鉴定证明该分离病毒为NDV,根据GenBank公布的新城疫病毒的全基因序列,在同源区设计14对引物扩增接种SPF鸡胚尿囊腔P1代的病毒的全基因组,并进行测序分析。又将该病毒接种CEF进行噬斑纯化,共挑取5个克隆株进行全基因组的测序分析,发现接种鸡胚尿囊腔(ck/CH/LSD/08-29)和接种CEF的病毒毒株(ck/CH/LSD/08-29(CEF))的全基因组序列相差很大,表明不是同一株病毒。在最初的发病鸡病料中存在两个病毒株,可能这两个病毒株在接种不同的宿主分别有不同的生长优势。病毒连续接种不同的宿主,其病毒毒力、嗜性和免疫原性等特性都会发生改变,将接种鸡胚尿囊腔的P1代的病毒分别接种SPF鸡胚和CEF连续传代,扩增传代过程中病毒的基因序列,判断两株病毒在鸡胚和CEF中传代的含量变化。 分别分析测得的两株病毒的全基因序列,构建基因遗传进化树,毒株ck/CH/LSD/08-29属于基因Ⅱ型,毒株ck/CH/LSD/08-29(CEF)属于基因Ⅶ型。在CEF传代的优势毒株和5株水禽源的NDV亲缘关系最近,可能该毒株是从水禽体内传给鸡群的。而和在鸡胚中传代的优势毒株亲缘关系最近的NDV是一株人为的重组毒株,该重组毒株是以LaSota为载体,将一株基因Ⅶ型的NDV强毒株的F和HN基因替换LaSota毒株的F和HN基因,而且构建的毒株ck/CH/LSD/08-29各个基因的遗传进化树也显示毒株的F和HN基因和强毒株的亲缘关系最近,而NP和P基因和弱毒株的亲缘关系较近,该毒株可能是一株重组的病毒,有待进一步研究。 设计6对鉴定特异性引物检验病毒在鸡胚和鸡胚成纤维细胞中传代的含量变化发现病毒在CEF中传代到P6代次时,尿囊液中的优势毒株ck/CH/LSD/08-29消失,在鸡胚尿囊液中传代到P11代次时CEF中的优势毒株ck/CH/LSD/08-29(CEF)消失。比对两株病毒的氨基酸序列发现HN蛋白序列相同,而NP、P和L蛋白的氨基酸差异较大,可能NDV的宿主嗜性除了与HN蛋白有关外还与此3种蛋白存在一定的相关性,说明NDV的嗜性可能是多基因相互作用的结果。 本研究扩增了两株NDV的全基因组序列丰富了新城疫病毒的生物学信息数据库,比较了两株病毒在鸡胚尿囊腔中和CEF中传代含量变化并初步分析NDV在不同宿主适应的优势与基因的关系。


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